新近的一些研究表明，神經(jīng)元和免疫細(xì)胞共同合作來(lái)調(diào)節(jié)抗微生物免疫、炎癥和組織穩(wěn)態(tài)。例如，神經(jīng)元變阻器提供興奮或抑制信號(hào)，控制黏膜屏障表面II型固有淋巴細(xì)胞（ILC2）的功能。ILC2則表達(dá)神經(jīng)調(diào)節(jié)肽U（NMU）的受體NMUR1，NMU是一種膽堿能神經(jīng)肽，可刺激ILC2增殖并產(chǎn)生II型細(xì)胞因子。

然而，ILC2與適應(yīng)性淋巴細(xì)胞擁有許多共同功能。例如，它們都能產(chǎn)生II型細(xì)胞因子，釋放保護(hù)組織的雙調(diào)蛋白（AREG），在促進(jìn)抗寄生蟲免疫、代謝穩(wěn)態(tài)和組織保護(hù)方面發(fā)揮著重要作用。這就引發(fā)了科學(xué)界的爭(zhēng)議，ILC2在體內(nèi)是執(zhí)行冗余功能還是非冗余功能？

威爾·康奈爾醫(yī)學(xué)院領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)利用一種新的遺傳工具，證明ILC2在保護(hù)屏障組織免受寄生蟲感染以及腸道損傷和炎癥后的組織保護(hù)方面發(fā)揮著非冗余作用。這項(xiàng)研究成果發(fā)表在《Nature》雜志上。
 

圖片來(lái)源：《Nature》
（https://www.nature.com/articles/s41586-022-05297-6）

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員委托賽業(yè)生物構(gòu)建了Nmur1^iCre-eGFP小鼠。這種新的遺傳工具能夠在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)存在的情況下，以ILC2為靶點(diǎn)進(jìn)行基因敲除。在此基礎(chǔ)上，他們又構(gòu)建了Areg^ΔILC2小鼠，以探究ILC2來(lái)源的AREG的潛在作用。他們利用小鼠腸道感染和炎癥模型及潰瘍性結(jié)腸炎患者的腸道樣本來(lái)分析AREG的功能，并在分析過(guò)程中采用了流式分選和免疫熒光染色等技術(shù)。

技術(shù)路線
01 構(gòu)建Nmur1^iCre-eGFP小鼠，實(shí)現(xiàn)ILC2的特異性靶向
02 構(gòu)建Areg^ΔILC2小鼠，實(shí)現(xiàn)ILC2特異性的Areg敲除
03 利用小鼠腸道感染和炎癥模型來(lái)分析ILC2來(lái)源的AREG的潛在功能
04 探究神經(jīng)元產(chǎn)生的NMU是否能調(diào)節(jié)ILC2來(lái)源的AREG的功能

研究結(jié)果
1 一種新型的遺傳工具
為了描繪ILC2和適應(yīng)性淋巴細(xì)胞的不同功能，研究人員根據(jù)NMUR1在ILC2上的表達(dá)模式，開(kāi)發(fā)出一種在體內(nèi)靶向ILC2的新型遺傳工具。他們委托賽業(yè)生物構(gòu)建了Nmur1^iCre-eGFP小鼠，這種小鼠表達(dá)iCre重組酶和eGFP報(bào)告基因，它們位于Nmur1啟動(dòng)子的下游（圖1）。他們發(fā)現(xiàn)，NMUR1–eGFP報(bào)告基因僅在ILC2中高表達(dá)，而在ILC1和ILC3亞群以及適應(yīng)性淋巴細(xì)胞中的表達(dá)量極低甚至沒(méi)有。

為證實(shí)這些結(jié)果，研究人員構(gòu)建了Nmur^1iCre-eGFPROSA26^LSL-RFP小鼠。在各種組織中，幾乎所有ILC2和ILC2前體都觀察到iCre誘導(dǎo)的RFP表達(dá)，而在其他免疫細(xì)胞中只有極少的誘導(dǎo)。此外，他們還構(gòu)建了Nmur1^iCre-eGFPROSA26^LSL-DTR小鼠，這個(gè)品系能夠組成型表達(dá)白喉毒素受體。在注射白喉毒素后，小鼠多個(gè)組織中的ILC2幾乎被完全清除。這些數(shù)據(jù)表明，Nmur1^iCre-eGFP小鼠為報(bào)告Nmur1表達(dá)和體內(nèi)多個(gè)組織中的ILC2特異性消融提供了一種新工具。
 

圖1 NMUR1–eGFP報(bào)告基因在ILC2中高表達(dá)^[1]

2 ILC2來(lái)源的AREG發(fā)揮非冗余功能
ILC2富集于包括腸道在內(nèi)的屏障表面，通過(guò)釋放雙調(diào)蛋白（AREG）來(lái)介導(dǎo)組織修復(fù)和穩(wěn)態(tài)。為了研究ILC2來(lái)源的AREG的潛在非冗余作用，研究人員需要對(duì)Areg進(jìn)行靶向敲除�？紤]到只有一小部分AREG⁺ ILC2共表達(dá)IL-5，但大多數(shù)AREG⁺ ILC2也表達(dá)NMUR1，他們認(rèn)為，與Il5^Cre-tdTomato（Red5）小鼠品系相比，他們認(rèn)為Nmur1^iCre-eGFP小鼠能夠?qū)崿F(xiàn)ILC2中更靶向且更高效的Areg敲除。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，他們構(gòu)建了Areg^fl/-小鼠，將其與Red5或Nmur1^iCre-eGFP小鼠雜交，分別產(chǎn)生了Areg^ΔRed5和Areg^ΔILC2小鼠。對(duì)于Areg^ΔRed5小鼠，ILC2中AREG表達(dá)量沒(méi)有明顯下降，但對(duì)于Areg^ΔILC2小鼠，ILC2中AREG的表達(dá)幾乎完全缺失，實(shí)現(xiàn)了ILC2特異性的Areg敲除。

接下來(lái)，研究人員利用小鼠腸道感染和炎癥模型來(lái)檢驗(yàn)AREG在體內(nèi)是執(zhí)行冗余還是非冗余功能。他們觀察到，在鼠鞭蟲（Trichuris muris）感染野生型小鼠后，盲腸ILC2產(chǎn)生的AREG增加，表明ILC2來(lái)源的AREG可能在促進(jìn)抗寄生蟲反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。與Areg^fl/-對(duì)照組相比，Areg^ΔILC2小鼠的ILC2中AREG表達(dá)量極低，而且感染后小鼠杯狀細(xì)胞的反應(yīng)程度顯著降低（圖2），這與之前的研究一致，表明AREG可調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞反應(yīng)，包括分化為杯狀細(xì)胞來(lái)分泌粘液。同時(shí)，Areg^ΔILC2小鼠體內(nèi)的寄生蟲數(shù)量也明顯多于Areg^fl/-小鼠。

考慮到TH2細(xì)胞和Treg細(xì)胞在某些情況下也能產(chǎn)生AREG，研究人員進(jìn)一步分析了鼠鞭蟲感染后盲腸ILC2、Treg細(xì)胞和效應(yīng)CD4⁺ T細(xì)胞產(chǎn)生AREG的動(dòng)力學(xué)。從數(shù)量上看，ILC2和Treg細(xì)胞是AREG的主要來(lái)源，而產(chǎn)生AREG的CD4⁺ T細(xì)胞只占少數(shù)。與Areg^fl/-小鼠相比，Areg^ΔCD4小鼠（CD4⁺ T細(xì)胞區(qū)室缺乏AREG表達(dá)）在感染后的寄生蟲數(shù)量相當(dāng)，這表明ILC2來(lái)源的AREG通過(guò)調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞反應(yīng)，在抗蠕蟲免疫中發(fā)揮著重要而非冗余的作用。

此外，ILC2也在腸道損傷后的組織保護(hù)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。不過(guò)，ILC2產(chǎn)生的AREG是否是促進(jìn)組織保護(hù)機(jī)制所必需的，目前還不清楚。于是，研究人員將Areg^ΔILC2小鼠暴露在DSS下以誘導(dǎo)腸道損傷和炎癥。與Areg^fl/-對(duì)照組相比，Areg^ΔILC2小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的疾病，表現(xiàn)為體重明顯下降和腸上皮損傷（圖2）。這表明在缺乏ILC2來(lái)源的AREG的情況下，組織保護(hù)反應(yīng)明顯受損，且其他細(xì)胞來(lái)源的AREG無(wú)法補(bǔ)償ILC2來(lái)源的AREG。由此可見(jiàn)，ILC2來(lái)源的AREG在非感染性腸道損傷和炎癥中介導(dǎo)了組織保護(hù)的非冗余作用。
 

圖2 ILC2來(lái)源的AREG對(duì)清除寄生蟲和腸道損傷后的組織保護(hù)至關(guān)重要^[1]

3 NMU誘導(dǎo)人類和小鼠ILC2產(chǎn)生AREG
最近的研究發(fā)現(xiàn)了多種神經(jīng)肽，它們可在屏障表面對(duì)ILC2功能進(jìn)行正向或負(fù)向調(diào)節(jié)，例如，NMU可促進(jìn)ILC2產(chǎn)生II型細(xì)胞因子。那么，NMU是否能調(diào)節(jié)ILC2來(lái)源的AREG的非冗余組織保護(hù)功能呢？研究人員觀察到，對(duì)于暴露于DSS和鼠鞭蟲感染的小鼠，結(jié)腸內(nèi)Nmu的表達(dá)顯著增加，且Nmu的表達(dá)僅限于腸神經(jīng)元亞群。

在小鼠體內(nèi)注射NMU會(huì)導(dǎo)致ILC2產(chǎn)生的AREG增加，但不會(huì)導(dǎo)致CD4⁺ T細(xì)胞產(chǎn)生的AREG增加（圖3）。與此一致的是，與對(duì)照組相比，暴露于DSS的小鼠注射NMU后，上皮隱窩結(jié)構(gòu)得到改善，因此疾病嚴(yán)重程度大大減輕（圖3）。由于Areg^ΔILC2小鼠在接受NMU處理后腸上皮結(jié)構(gòu)沒(méi)有得到改善，他們認(rèn)為NMU的組織保護(hù)作用依賴于ILC2來(lái)源的AREG。這些數(shù)據(jù)表明，炎癥誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生的NMU和ILC2介導(dǎo)的組織保護(hù)之間存在關(guān)聯(lián)。

最后，研究人員試圖以人類腸道炎癥為背景，看看MNU和ILC2–AREG軸之間是否存在關(guān)聯(lián)。與小鼠腸道炎癥模型中的結(jié)果一致，潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道樣本中的NMU表達(dá)相對(duì)于健康樣本增加。而且，對(duì)于從炎癥性腸病患者腸活檢樣本中分離出的ILC2，體外NMU刺激導(dǎo)致AREG的上調(diào)（圖3）。由此可見(jiàn)，NMU調(diào)節(jié)的ILC2-AREG反應(yīng)是一種進(jìn)化保守的組織保護(hù)機(jī)制，在腸道損傷和炎癥發(fā)生時(shí)激活。
 

圖3 NMU介導(dǎo)了ILC2來(lái)源的AREG的非冗余組織保護(hù)功能^[1]

研究結(jié)論
研究人員總結(jié)道，利用新的遺傳工具，他們證明了在適應(yīng)性免疫反應(yīng)起作用的情況下，腸道粘膜屏障的損傷會(huì)導(dǎo)致腸神經(jīng)元中NMU上調(diào)，而NMU會(huì)刺激結(jié)腸ILC2產(chǎn)生AREG。通過(guò)這條由NMU調(diào)節(jié)的ILC2-AREG通路，ILC2在促進(jìn)抗寄生蟲免疫以及組織保護(hù)方面發(fā)揮了重要的非冗余作用，這有望為多種感染和炎癥的治療提供新的見(jiàn)解。

參考文獻(xiàn)：
[1]Tsou, A.M., Yano, H., Parkhurst, C.N. et al. Neuropeptide regulation of non-redundant ILC2 responses at barrier surfaces. Nature 611, 787–793 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05297-6