血管重構(gòu)（VR）是以血管阻力增加、內(nèi)膜增厚、節(jié)段性狹窄或動脈瘤樣擴(kuò)張為特征的復(fù)雜的結(jié)構(gòu)性病理改變，是多種心血管疾�。–VDs）的重要病理性標(biāo)志。血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）通過感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)重構(gòu)的刺激，產(chǎn)生調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)組成的介質(zhì)，促進(jìn)血管重塑。內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndoMT）作為一種內(nèi)皮異常狀態(tài)，廣泛參與動脈粥樣硬化和心臟纖維化等疾病，但其在VR的作用和機(jī)制尚未闡明。糖酵解（Glycolysis）過程在內(nèi)皮多種病理狀態(tài)下功能實(shí)現(xiàn)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但其對EndoMT及VR發(fā)生發(fā)展的作用和調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

2023年10月5日，廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院心血管平臺徐益鳴教授團(tuán)隊(duì)在Hypertension（醫(yī)學(xué)1區(qū)，IF=8.3）上發(fā)表了題為“Glycolysis Promotes Angiotensin II-Induced Aortic Remodeling Through Regulating Endothelial-to-Mesenchymal Transition via the Corepressor C-Terminal Binding Protein 1”的研究論文，揭示了內(nèi)皮細(xì)胞中PFKFB3介導(dǎo)的糖酵解對EndoMT激活的全新調(diào)控通路及其在VR進(jìn)程中的關(guān)鍵作用，為抗VR治療提供了全新的代謝干預(yù)靶點(diǎn)。該論文的通訊作者為徐益鳴教授，第一作者為復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院博士生王立濤和廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院博士生郭帥。
 

圖片來源：《Hypertension》
（https://doi.org/10.1161/HYPERTENSIONAHA.123.21382）

研究材料
在此項(xiàng)目中，研究人員構(gòu)建了內(nèi)皮特異性PFKFB3敲除小鼠模型（Pfkfb3^iECKO）探究內(nèi)皮PFKFB3對EndoMT激活及VR進(jìn)程的調(diào)控作用。隨后使用AAV病毒（由賽業(yè)生物提供）實(shí)現(xiàn)了在內(nèi)皮中對CtBP1的點(diǎn)突變，并進(jìn)行了詳細(xì)的下游機(jī)制驗(yàn)證。

研究方法
在此項(xiàng)目中研究人員采用了多項(xiàng)在體和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，包括en face免疫熒光、主動脈HE、SR和EVG染色、Western blotting及RT-PCR等。在探究CtBP1與E2F4的結(jié)合對SMURF2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用時(shí)，研究人員使用了CHIP及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。此外，研究人員還測量了胞內(nèi)NADH和NAD+的水平。

技術(shù)路線
01 VR中EndoMT與PFKFB3的表達(dá)相關(guān)性
02 體內(nèi)外抑制PFKFB3對EndoMT及VR進(jìn)程的影響
03 PFKFB3調(diào)控EndoMT過程的分子機(jī)制
04 CtBP1/E2F4轉(zhuǎn)錄復(fù)合物對EndoMT和VR的調(diào)控作用及其機(jī)制

研究結(jié)果
1 VR病理狀態(tài)下EndoMT過程和內(nèi)皮TGF-β1/SMAD2信號被激活
首先研究人員通過Ang II皮下緩釋誘導(dǎo)的小鼠血管重塑模型。為了評估EndoMT在血管重塑中的發(fā)生情況，選取省里鹽水或Ang II緩釋7天的小鼠胸主動脈進(jìn)行檢測。En face免疫熒光染色顯示，與生理鹽水處理的小鼠相比，Ang II緩釋后VE-cadherin（ECs標(biāo)志物）的表達(dá)明顯減少，而Vimentin（間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）的表達(dá)明顯增加，提示EndoMT過程被激活。此外，在Ang II緩釋的小鼠胸主動脈內(nèi)皮層觀察到TGF-β1信號中間體SMAD2的磷酸化增加。以上結(jié)果表明，在Ang II誘導(dǎo)的血管重塑過程中，內(nèi)皮TGF-β/SMAD2信號和EndoMT過程被激活。
 

圖1 VR病理狀態(tài)下EndoMT過程和內(nèi)皮TGF-β1/SMAD2信號被激活^[1]

2 EndoMT過程伴隨PFKFB3介導(dǎo)的糖酵解增加
隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)Ang II緩釋的小鼠主動脈內(nèi)皮中糖酵解關(guān)鍵酶PFKFB3的表達(dá)顯著升高。通過使用TGF-β1刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）誘導(dǎo)EndoMT，細(xì)胞明場拍照結(jié)果顯示TGF-β1處理使HUVECs表現(xiàn)為成纖維或間充質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，同時(shí)細(xì)胞的伸長指數(shù)也顯著升高。此外，與動物水平的結(jié)果一致，TGF-β1體外處理顯著增加了糖酵解關(guān)鍵酶PFKFB3的表達(dá)水平。海馬細(xì)胞外通量分析也提示TGF-β1處理的HUVECs中基礎(chǔ)糖酵解、糖酵解能力、最大糖酵解和糖酵解儲備均有所增加；基因敲除PFKFB3能顯著降低TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞糖酵解水平升高。

為了進(jìn)一步探究TGF-β1誘導(dǎo)PFKFB3蛋白表達(dá)升高的機(jī)制，研究人員使用JASPAR軟件分析了PFKFB3的啟動子區(qū)域，并發(fā)現(xiàn)了兩個SMAD2/3結(jié)合元件（SMAD2/3 binding elements, SBEs）。進(jìn)一步使用抗SMAD2/3的抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SMAD2/3能夠與PFKFB3上包含SEBs的啟動子區(qū)域結(jié)合，而且這種結(jié)合在TGF-β1處理后顯著增加。此外，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，SMAD2/3的過表達(dá)以劑量依賴性的方式顯著增加PFKFB3的啟動子活性，進(jìn)一步證明PFKFB3是SMAD2/3復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)。

綜上所述，在EndoMT過程中，TGF-β1/SMAD2信號通過轉(zhuǎn)錄激活PFKFB3基因，誘導(dǎo)內(nèi)皮糖酵解升高。
 

圖2 EndoMT過程伴隨PFKFB3介導(dǎo)的糖酵解增加^[1]

3 內(nèi)皮PFKFB3介導(dǎo)EndoMT和VR形成
為了剖析內(nèi)皮PFKFB3上調(diào)在Ang II誘導(dǎo)的血管重塑中的功能性作用，研究人員構(gòu)建了他莫昔芬誘導(dǎo)的內(nèi)皮特異性Pfkfb3敲除（Pfkfb3^iECKO）和對照組（Pfkfb3^fl/fl）小鼠。將Pfkfb3^fl/fl和Pfkfb3^iECKO小鼠經(jīng)Ang II皮下緩釋14天后，進(jìn)行組織學(xué)染色和分析。而經(jīng)Ang II緩釋后，Pfkfb3^fl/fl小鼠胸主動脈的中膜和外膜膠原含量、中膜厚度、以及外層彈性纖維（EEL）周長顯著增加；然而，所有這些病理特征在Pfkfb3^iECKO小鼠中都得到改善。此外，en face染色顯示PFKFB3缺失顯著抑制了Ang II誘導(dǎo)的EndoMT過程和p-SMAD2水平的升高。以上結(jié)果表明內(nèi)皮PFKFB3缺乏能夠減輕Ang II誘導(dǎo)的主動脈重塑和EndoMT。
 

圖3 內(nèi)皮PFKFB3介導(dǎo)EndoMT和VR形成^[1]

4 NADH依賴性的CtBP1激活對于EndoMT的誘導(dǎo)至關(guān)重要
此前的證據(jù)表明NADH/NAD⁺比率增加與糖酵解的熱力學(xué)耦合，在基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮著根本性的作用。研究人員首先發(fā)現(xiàn)，TGF-β1處理顯著提高HUVECs中的NADH含量和NADH/NAD⁺比率，基因敲除或PFK158藥物抑制PFKFB3則能逆轉(zhuǎn)這一變化，但均不影響NAD⁺的水平。為了明確NADH/NAD⁺比率增加與EndoMT之間的功能關(guān)系，研究人員使用4-甲硫基-2-氧代丁酸（MTOB）耗竭胞內(nèi)NADH，結(jié)果發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)了ECs中間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的上調(diào)和內(nèi)皮標(biāo)志物的下調(diào)。羧基末端結(jié)合蛋白1（CtBP1）是一種眾所周知的NADH敏感型的蛋白，并被證實(shí)可作為轉(zhuǎn)錄共抑制因子調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。SiRNA敲除CtBP1能夠模擬PFKFB3缺失的抑制EndoMT效應(yīng)。隨后，研究人員通過構(gòu)建對NADH不敏感的CtBP1突變體（CtBP1^G183A），發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CtBP1^G183A幾乎完全逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的EndoMT過程（其中使用的AAV9-CDH5>Ctbp1（WT）和AAV9-CDH5>Ctbp1（G183A）病毒由賽業(yè)生物提供）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明PFKFB3驅(qū)動的糖酵解以NADH/CtBP1依賴性的方式正向調(diào)控EndoMT。
 

圖4 NADH依賴性的CtBP1激活對于EndoMT的誘導(dǎo)至關(guān)重要^[1]

5 PFKFB3/NADH/CtBP1軸通過抑制SMURF2促進(jìn)EndoMT
為了更深入地探究糖酵解依賴性的CtBP1激活如何調(diào)控EndoMT過程，研究人員發(fā)現(xiàn)敲除PFKFB3或CtBP1均能夠減輕TGF-β1誘導(dǎo)的SMAD2磷酸化。隨后，通過篩選一系列經(jīng)典的TGF-β1/SMAD2信號的調(diào)控因子，研究人員篩選出SMAD泛素調(diào)節(jié)因子2（SMURF2）是潛在的PFKFB3/NADH/CtBP1軸的作用靶點(diǎn)。過表達(dá)野生型CtBP1^WT能夠劑量依賴性降低SMURF2的表達(dá)；然而，過表達(dá)突變型CtBP1^G183A則逆轉(zhuǎn)了對SMURF2的抑制作用。敲除SMURF2能夠消除PFKFB3缺失對SMAD2信號的去激活作用。綜上所述，PFKFB3/NADH/CtBP1軸通過抑制SMURF2的表達(dá)激活TGF-β1/SMAD2信號通路。
 

圖5 PFKFB3/NADH/CtBP1軸通過抑制SMURF2促進(jìn)EndoMT^[1]

6 CtBP1/E2F4復(fù)合物轉(zhuǎn)錄抑制SMURF2的表達(dá)
CtBP1作為轉(zhuǎn)錄共抑制因子，既往研究報(bào)道CtBP1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制功能依賴于CtBP1與其他轉(zhuǎn)錄抑制因子的結(jié)合。研究人員通過大數(shù)據(jù)篩選發(fā)現(xiàn)E2F4是CtBP1發(fā)揮抑制作用潛在的轉(zhuǎn)錄抑制因子。免疫共沉淀（Co-IP）和Re-ChIP實(shí)驗(yàn)共同表明CtBP1與E2F4能夠直接結(jié)合，并形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與SMURF2啟動子結(jié)合。PFKFB3敲除或MTOB處理能夠抑制以上結(jié)合。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)則進(jìn)一步提示E2F4過表達(dá)抑制能夠SMURF2啟動子區(qū)域的活性，野生型（WT）而非突變型（G183A）CtBP1的過表達(dá)明顯加強(qiáng)TGF-β1處理下E2F4的抑制作用。這些數(shù)據(jù)表明CtBP1與E2F4結(jié)合共同轉(zhuǎn)錄抑制了SMURF2在TGF-β1處理下的表達(dá)。
 

圖6 CtBP1/E2F4復(fù)合物轉(zhuǎn)錄抑制SMURF2的表達(dá)^[1]

研究結(jié)論
此項(xiàng)研究首次證實(shí)內(nèi)皮PFKFB3介導(dǎo)的糖酵解通過調(diào)控EndoMT促進(jìn)VR過程。機(jī)制探索表明糖酵解依賴性的NADH水平升高介導(dǎo)了CtBP1/E2F4轉(zhuǎn)錄復(fù)合物對TGF-β1/SMAD2信號負(fù)性調(diào)控因子SMURF2的轉(zhuǎn)錄抑制，進(jìn)而促進(jìn)EndoMT和VR。此項(xiàng)研究也首次闡明干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞PFKFB3或CtBP1活性可以緩解VR，為VR的防治提供了新的干預(yù)靶點(diǎn)。
 

圖7 機(jī)制圖^[1]

參考文獻(xiàn)：
[1]Wang L, et al. Glycolysis Promotes Angiotensin II-Induced Aortic Remodeling Through Regulating Endothelial-to-Mesenchymal Transition via the Corepressor C-Terminal Binding Protein 1. Hypertension. 2023 Dec;80(12):2627-2640. doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.123.21382.