牙頜面畸形給患者帶來了很多身心困擾。正畸牙齒移動(dòng)（OTM）是解決此問題的主要策略，通過應(yīng)用固定的或可移動(dòng)的機(jī)械性手段來調(diào)整牙齒排列，這涉及牙槽骨和支撐牙周組織的生物力學(xué)適應(yīng)。引入生物療法來輔助這種機(jī)械誘導(dǎo)的物理運(yùn)動(dòng)，通過加快局部移動(dòng)速度或精確增加牙槽中的牙齒錨定，來縮短治療周期并減少患者因疼痛和不適引起的不依從性，引起了研究人員極大的關(guān)注�，F(xiàn)有的生物療法包括化學(xué)方法（細(xì)胞因子、激素、藥物、生長因子和其他生物物質(zhì)）和基因療法，其中最有潛力的轉(zhuǎn)化方法是局部給藥。

辛伐他�。⊿MV）作為 HMG-CoA 還原酶抑制劑，是一種降膽固醇的他汀類藥物。根據(jù)臨床試驗(yàn)觀察，SMV的攝入有利于慢性牙周炎的控制，因?yàn)樗�具有限制炎癥和修復(fù)牙周組織的功能。動(dòng)物研究表明，全身施用 SMV 可增加牙齒錨固并減少牙根吸收。因此，有可能假設(shè) SMV 在生物力學(xué)誘導(dǎo)的炎癥條件下對(duì)牙周組織具有骨合成代謝特性。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是絲/蘇氨酸蛋白激酶，主要協(xié)調(diào)代謝和能量的需要。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)了它在誘導(dǎo)自噬、炎癥控制、腫瘤轉(zhuǎn)移和自身免疫抑制中的作用。此外，還發(fā)現(xiàn)AMPK-α1敲除（AMPK-α1-/-）小鼠表現(xiàn)出比野生型（WT）小鼠更大的炎性牙周骨缺損，并表達(dá)更高水平的炎性細(xì)胞因子。有趣的是，OTM是一個(gè)生物力學(xué)過程，伴隨著張力側(cè)骨再生和壓力側(cè)骨吸收，這表明在生物力學(xué)刺激下，AMPK在炎癥介導(dǎo)的成骨過程中激活。

目前的體外觀察基于靜態(tài)培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞（PDLCs），這導(dǎo)致 PDLCs 在 OTM 期間的實(shí)際應(yīng)力狀態(tài)存在很大不一致。在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院口腔科、寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院口腔頜面外科及美國奧古斯塔大學(xué)牙科學(xué)院口腔生物學(xué)和診斷科學(xué)系課題組的一項(xiàng)聯(lián)合研究中，采用體外動(dòng)態(tài)張力拉伸培養(yǎng)系統(tǒng)模擬OTM中的應(yīng)力條件，重點(diǎn)關(guān)注了 SMV 在嚙齒動(dòng)物模型中對(duì)正畸移動(dòng)牙齒張力側(cè)的抗炎作用，并探索了AMPK調(diào)控的潛在機(jī)制。研究成果發(fā)表在 The Journal of Cellular and Molecular Medicine 期刊題為“Local delivery of simvastatin maintains tooth anchorage during mechanical tooth moving via anti-inflammation property and AMPK/MAPK/NF-kB inhibition”。
 

通過應(yīng)用體外張力系統(tǒng)加載外部機(jī)械刺激，將PDLCs用 10% 等雙軸應(yīng)變以 0.1Hz 拉伸24小時(shí)，然后分為六組：
1. C-CON：無張力和無 SMV；
2. C-SMV：無張力+0.05UM SMV；
3. T-CON：僅張力；
4. T-SMV：張力+0.05UM SMV；
5. T-Compound C：張力+0.05UM SMV+1UM Compound C（AMPK抑制劑）；
6. T-AICAR：張力+0.05UM SMV+1UM Compound C+1MM AICAR（AMPK激活劑）。

首先，通過比較PDLCs在藥物濃度梯度增加下的增殖率，實(shí)驗(yàn)確定了用于體外測試的適當(dāng)SMV濃度，基因表達(dá)水平的變化表明，0.05UM SMV誘導(dǎo)PDLCs的成骨和血管生成分化最強(qiáng)，因此選擇0.05UM SMV進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

SMV 具有保護(hù)性骨合成代謝和抗骨吸收特性，接下來實(shí)驗(yàn)專注于確定負(fù)責(zé) SMV 在增加牙齒錨固方面的治療效果的內(nèi)在因素。通過利用蛋白質(zhì)陣列技術(shù)，掃描了張力和 SMV-致敏的共刺激的PDLCs 中 20 種促炎因子和抗炎因子，發(fā)現(xiàn)IL-6是PDLCs在共刺激下誘導(dǎo)的最顯著的細(xì)胞因子。為了檢測AMPK在SMV誘導(dǎo)的抗炎過程中的潛在作用，隨后測量了細(xì)胞中p-AMPK/AMPK和p-P65/P65（NF-κB）的表達(dá)水平，數(shù)據(jù)表明，AMPK的增加與IL-6的分泌呈負(fù)相關(guān)。

通過給藥 AMPK 抑制劑Compound C 和 AMPK 激活劑 AICAR 來分析 AMPK 信號(hào)傳導(dǎo)的干預(yù)。RUNX2、BMP-2 和 VEGF 是成骨過程中的重要因素。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，機(jī)械張力顯著增加了BMP-2和VEGF的表達(dá)，RUNX2表達(dá)沒有明顯的增強(qiáng)。然而，SMV的加入顯著提高了三個(gè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平（圖1 A-C）。SMV給藥在靜態(tài)環(huán)境下增加促炎因子的表達(dá)，但在張力刺激下，這種變化被逆轉(zhuǎn)，Compound C和AICAR的預(yù)處理進(jìn)一步證明了這一趨勢（圖1 D）。抑制AMPK在所有時(shí)間點(diǎn)均顯著升高NF-κB表達(dá)，但在加入AICAR后，這種變化被逆轉(zhuǎn)。然而，張力培養(yǎng)條件對(duì)RUNX2表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)影響（圖1 E），卻顯著增加了AMPK的表達(dá)，SMV給藥在6h和12h 時(shí)協(xié)同提高了其表達(dá)水平，但Compound C 可以抑制這種變化（圖1 F）。這些結(jié)果表明，SMV通過抗炎作用促進(jìn)OTM期間牙周組織張力側(cè)的成骨。

圖1 誘導(dǎo) 6 小時(shí)、12 小時(shí)和 1 天后的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測。
（A）RUNX2的折疊表達(dá)。（B）BMP-2的折疊表達(dá)。（C）VEGF的折疊表達(dá)。（D）TNF-ɑ的折疊表達(dá)。（E）NF-κB的折疊表達(dá)。（F）AMPK的折疊表達(dá)。

接下來，為了進(jìn)一步闡明AMPK在張力條件下對(duì)SMV刺激的PDLCs的影響，實(shí)驗(yàn)通過Western blot檢測了MAPK/NF-κB信號(hào)（圖2 A)。結(jié)果顯示，0.05UM SMV處理下調(diào)了p-ERK、p-P38和p-P65的折疊表達(dá)（圖2 B），但這種變化會(huì)被Compound C 改變，并進(jìn)一步被AICAR恢復(fù)，這與p-AMPK水平呈負(fù)相關(guān)。然后通過ELISA檢測了處理的上清液中TNF-α和IL-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)張力和SMV共同刺激下TNF-α和IL-1的分泌量與NF-κB p65磷酸化水平表現(xiàn)出相似的變化模式（圖2 C）。這說明，SMV降低了炎癥因子水平。 SMV 通過抑制 AMPK/MAPK/NF-ΚB 促進(jìn) OTM 期間牙周組織張力側(cè)的成骨。

圖2 蛋白質(zhì)印跡分析。
（A）AMPK、ERK1/2、P38、P65的蛋白表達(dá)及其磷酸化水平。（B）p-AMPK/AMPK，p-ERK/ERK，p-P38/P38 和 p-P65/P65 的相對(duì)牙科光學(xué)。

最后，研究人員對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠分別進(jìn)行了手術(shù)觀察、顯微CT評(píng)估和組織學(xué)觀察。實(shí)驗(yàn)中共有24只 SD 大鼠接受了正畸矯治器放置。在7天的預(yù)處理期間，所有大鼠總體健康狀況良好，然后加載機(jī)械刺激，觀察到炎癥反應(yīng)有限的部位。

然后進(jìn)行顯微CT評(píng)估，對(duì)照組上頜第一磨牙遠(yuǎn)端根部周圍出現(xiàn)大量骨吸收，SMV組遠(yuǎn)端根部周圍骨骼高度基本維持在分叉位置。對(duì)照組上頜第一磨牙移動(dòng)距離顯著高于SMV組和AICAR組。對(duì)照組與Compound C 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，BV/TV百分比在對(duì)照組最低，SMV組最高，而Compound C處理使BV/TV降低，AICAR處理使其又顯著提高。

組織學(xué)觀察的H&E染色顯示牙周組織壓力側(cè)比張力側(cè)窄（圖3 A）。觀察遠(yuǎn)端牙根張力側(cè)（黃色方塊內(nèi)）的牙周膜，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組牙周膜厚度較大，排列更混亂，細(xì)胞核明顯長于其他三組。同時(shí)，SMV組牙周間隙的變化受到限制。其他三組張力側(cè)均未見明顯骨吸收部位，如黃色箭頭所示。在SMV組中檢測到少量的炎癥細(xì)胞的流入。Compound C組和AICAR組的組織學(xué)檢查結(jié)果介于前兩組之間。在細(xì)胞排列方面，Compound C組與對(duì)照組更相似。細(xì)胞核數(shù)的組織形態(tài)學(xué)評(píng)估證明了這一趨勢（圖3 B）。具體而言，對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)量多于SMV組、Compound C組和AICAR組。

免疫組織學(xué)染色顯示，對(duì)照組移動(dòng)磨牙張力側(cè)NF-κB和TNF-α表達(dá)呈強(qiáng)陽性。這兩個(gè)因子在SMV組中表達(dá)最弱，然而，在Compound C 組的牙周膜中可以看到它們均勻分散著色；兩個(gè)因子的染色細(xì)胞百分比在四組間的變化相同，這與H&E染色的組織形態(tài)學(xué)結(jié)果相似（圖3 C、D）。此外，在對(duì)照組中觀察到多個(gè)紅色染色的破骨細(xì)胞，但在SMV組和AICAR 組中幾乎沒有檢測到具有紅色破骨細(xì)胞的特征性骨吸收坑以及再吸收的骨表面。與對(duì)照組、Compound C 組和AICAR組相比，SMV組的Howship's lacunae（豪希普氏腔隙）數(shù)量較低。對(duì)照組與AICAR組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3 E）。在細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)量方面，對(duì)照組明顯大于其他3組（圖3 F）。

圖3 組織學(xué)和組織形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果。
（A）H&E染色、NF-κB和TNF-ɑ免疫組織學(xué)染色，4組的Trap染色。（B）細(xì)胞核數(shù)。（C）NF-κB陽性細(xì)胞評(píng)估。（D）TNF-ɑ陽性細(xì)胞評(píng)估。（E）Howship's lacunae數(shù)。（F）Trap染色細(xì)胞的陽性細(xì)胞。

總之，該研究表明，SMV 可以通過抑制 AMPK/MAPK/NF-kB 來促進(jìn) PDLCs 中 AMPK 的內(nèi)在激活，從而減輕在拉伸刺激下發(fā)生的炎癥。然而，該研究主要討論了張力刺激，不能代表牙齒在正畸力下的整體應(yīng)力狀態(tài)。此外，對(duì)機(jī)械性骨形成機(jī)制的完整理解需要對(duì)破骨細(xì)胞及其反應(yīng)進(jìn)行識(shí)別和分析。該研究確認(rèn)了AMPK/MAKP/NF-κB 通路的抑制介導(dǎo) SMV 骨保護(hù)作用對(duì) OTM 期間牙齒錨固的增強(qiáng)作用。

參考文獻(xiàn)：Xu L, Sun X, Zhu G, Mao J, Baban B, Qin X. Local delivery of simvastatin maintains tooth anchorage during mechanical tooth moving via anti-inflammation property and AMPK/MAPK/NF-kB inhibition. J Cell Mol Med. 2021 Jan;25(1):333-344. doi: 10.1111/jcmm.16058. Epub 2020 Dec 12. PMID: 33314684; PMCID: PMC7810950.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33314684/

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