介紹
來自動物的肽毒素是離子通道的有效抑制劑，無論是作為治療一系列疾病的藥物還是作為藥物研究的寶貴工具，都顯示出巨大的前景。法國的一個研究小組已經(jīng)探索了一種蝎子肽BeKm-1的熒光標記方法，這種肽可以抑制hERG離子通道。hERG離子通道與心臟活動有關，在開發(fā)新藥時必須避免阻斷它。研究小組的方法包括蛋白質-蛋白質對接研究，使他們能夠識別肽鏈中適合標記的溶劑暴露殘基。這使他們能夠設計和測試保持天然肽的特異性和作用方式的類似物。

肽毒素——藥物先導化合物和藥物研發(fā)工具的金礦
來自陸地和海洋動物的肽毒素是研究離子通道在生理和病理條件下所起作用的寶貴工具。僅蝎子毒液就含有多達320種肽毒素，這些肽毒素作用于41種不同的離子通道(1)。幾種毒素衍生的肽也已成為治療糖尿病、高血壓、慢性疼痛和其他疾病的藥物，同時有數(shù)十種處于臨床前開發(fā)或正在進行臨床試驗(2)。一個例子是FDA批準的多肽藥物Prialt®或Ziconotide，這是一種合成的25個氨基酸的肽，發(fā)現(xiàn)于海蝸牛的毒液中，可以阻斷N型電壓門控鈣離子通道。Ziconotide作為全身鎮(zhèn)痛藥，適用于鞘內(nèi)嗎啡不耐受或難治性慢性嚴重疼痛的患者(3)。成千上萬的多肽仍有待研究，作為可能的藥理工具或藥物先導化合物(4)。

設計毒素靶向hERG離子通道
該領域的關鍵驅動因素是目標通道晶體結構的可用性和對毒素結合的研究，這為設計毒素類似物開辟了可能性。一個例子是hERG通道，它與EAG -1通道同屬于EAG(ether-go-go)電壓門控K+通道家族。

編碼hERG通道的基因KCNH2突變可導致長QT間期延長綜合征(LQT)， LQT綜合征涉及心室復極延長，可導致心臟驟停。LQT也可由阻斷hERG的藥物引起，包括抗生素、抗精神病藥物和抗組胺藥。這種相互作用是藥物開發(fā)的主要挑戰(zhàn)，必須在開發(fā)過程的早期進行研究。

評估hERG的一個有力工具是以毒素肽BeKm-1 (IC50 =3.3 nM)形式存在的有效阻斷劑，該毒素肽是從蝎子Buthus eupeus的毒液中分離出來的。法國Molsamcules Max Mousseron研究所、Pole d'expertise Biotechnology公司和Smartox Biotechnology公司合作設計了BeKm-1的熒光類似物，專門結合hERG通道，目的是開發(fā)能夠保持正確結合和抑制該通道的熒光類似物(5)。

支持殘基選擇的模型
該團隊開發(fā)了一個試驗模型，使用四聚體hERG通道結構來預測BeKm-1與hERG外部部分的結合，以幫助識別肽毒素上暴露于溶劑中的殘基，可用于連接化學基團。分子模擬研究表明，肽毒素的α-螺旋與hERG結合位點底部的疏水表面接觸，并且N端 Arg-1和Arg-27的側鏈在所有結合模式下都暴露于溶劑，因此決定選擇這些殘基進行化學標記。

BeKm-1類似物的設計與合成
該團隊設計并合成了四種熒光BeKm-1類似物(圖1)。BeKm-1的N端用于將連接物連接到三種類似物上:4-戊酸(+ 4個碳原子; linker 4)，6-疊氮己酸(+6個碳原子; linker 6)，或10-十一烷酸(+ 10個碳原子;linker 10)。所有這些連接子都兼容點擊化學(linker 4和linker 10的炔功能，linker 6的疊氮化物功能)。第四個BeKm-1類似物是基于Arg-27的溶劑可及性，但由于Arg-27不參與hERG通道識別，殘基被含有炔功能的點擊化學兼容的Lys殘基所取代。然后將帶有額外間隔的Cy5染料基團連接到肽上。
 

在連接子偶聯(lián)到36-mer BeKm-1序列的N端之前，在Symphony®X全自動多肽合成儀上使用Fmoc固相化學逐步合成多肽鏈。在BeKm-1 Lys-27中，野生型L-Arg-27殘基被L-Lys(pentynoyl)-OH取代。間隔物GS在C端包含左丙炔甘氨酸(Pra)，在側鏈上具有炔基功能，Cy5在N端通過肽鍵偶聯(lián)。

所有多肽合成采用2-氯三甲基氯樹脂。經(jīng)過樹脂裂解和脫保護，粗毒素類似物被折疊/氧化，并通過C18反相色譜(RP-HPLC)純化。利用點擊化學方法將Cy5 與連接子偶聯(lián)得到Cy5- PEG3 -linker4- BeKm-1、Cy5- PEG5 -linker10- BeKm -1、Cy5-spacer- GS -linker6- BeKm -1和Cy5- PEG5 - BeKm -1 Lys275。所有產(chǎn)物均經(jīng)反相高效液相色譜純化。

類似物保留特異性和作用方式，但親和力降低
利用非洲爪蟾卵母細胞中表達的hERG通道，對熒光標記BeKm-1的效果進行了評價。所有類似物均表現(xiàn)出劑量依賴性的外向電流抑制作用，但IC50值(60-80 nM)高于天然毒素肽(12 nM;圖2). BeKm-1和四個類似物的Hill系數(shù)都接近于1，表明它們具有相同的作用模式。
 

天然BeKm-1及其類似物對hERG的特異性可以通過對密切相關的K+通道hEAG1缺乏影響來證實，而對一種抗BeKm-1抑制的突變形式的hERG進行的實驗顯示，天然肽及其類似物對hERG的特異性相似�？偟慕Y論是，這些類似物具有與天然肽相同的特異性和作用方式，但對hERG離子通道的親和力較低。

一種開發(fā)設計毒素肽的有前景的方法
這項研究說明了蛋白質-蛋白質對接工具如何用于修飾毒素肽的設計，這些修飾毒素肽可以用作離子通道成像或生物化學純化/表征中的報告分子。這樣的方法也可以提供有價值的工具來研究新的候選藥物對離子通道的不良副作用，表征肽毒素的作用模式，并為藥物開發(fā)開辟新的可能性。

正如Smartox Biotechnology CSO和INSERM高級研究主任Michel De Waard博士所指出的那樣，Symphony® X全自動多肽合成儀在這項工作中發(fā)揮了關鍵作用。“Symphony® X是我們在Smartox合成能力的寶貴補充。作為GPT產(chǎn)品的長期用戶，我們不僅依賴于該儀器的堅固結構和可靠性能，而且在生產(chǎn)含非天然氨基酸和特殊化學物質的多肽時，該儀器提供了更大的靈活性。能夠同時合成多種肽類似物是一個巨大的優(yōu)勢，使我們能夠提高我們實驗室多肽合成的效率和生產(chǎn)力。”

高通量多肽合成儀Symphony® X介紹

Symphony® X是由美國多肽合成儀領軍品牌PTI（GPT）推出的經(jīng)典產(chǎn)品，儀器24通道設計，采用固相合成的原理，可以同時合成24條不同序列的多肽。儀器具有40個氨基酸位、8個試劑瓶位，為客戶的研究、優(yōu)化和生產(chǎn)提供最大的靈活性。

*24個平行的獨立反應通道，可同時在多個RV上運行不同的合成規(guī)模、多肽序列和反應條件，或在運行其他項目時按需使用

*12個通道可作預活化

*反應溶液的實時紫外線監(jiān)測，而不是混合過程中的廢液檢測，以控制脫保護時間，并盡量減少多余的廢物，以獲得更好的純度和產(chǎn)量

*快速紅外加熱

*Single Shot^TM單次添加技術，幾乎沒有死體積

References

1.  Scorpion toxin peptide action at the ion channel subunit level. Housley, D.M et al. 2017.

Neuropharmacology 127, 46–78.

2.  Pharmacokinetics of Toxin-Derived Peptide Drugs. Stepensky, D. Toxins 2018, 10, 483;

doi:10.3390/toxins10110483.

3.  Toxins in Drug Discovery and Pharmacology. Peigneur S & Tytgat J. Toxins (Basel). 2018 Mar 16;10(3). pii: E126. doi: 10.3390/toxins10030126.

4.  de Souza, J.M., et al, 2018. Animal toxins as therapeutic tools to treat neurodegenerative

diseases. Front. Pharmacol. 9, 145.

5.  Fluorescent analogues of BeKm-1 with high and specific activity against the hERG channel.

Vasseur, L et al Toxicon: X, Volume 2, April 2019, 100010