上周四，賽業(yè)生物生產(chǎn)中心負(fù)責(zé)人蘇翠主講的「小鼠基因型鑒定的策略及常見(jiàn)問(wèn)題」線上課程，以下為本次直播常見(jiàn)問(wèn)題匯總與解答。

FAQ:
1.鑒定基因型有時(shí)候擴(kuò)出很多弱的雜帶怎么辦？
2.同一個(gè)小鼠的一個(gè)基因位點(diǎn)鑒定不出來(lái)，其他基因都可以鑒定出來(lái)？
3.如果人源化小鼠的插入位點(diǎn)是未知的，該如何設(shè)計(jì)引物進(jìn)行鑒定呢?
4.PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)該怎么選擇呢？
5.PCR條帶為150bp以下，電泳條帶非常模糊，有什么好的方法嗎？

Q 鑒定基因型有時(shí)候擴(kuò)出很多弱的雜帶怎么辦？
A PCR擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生非特異條帶，一般與引物的特異性、退火溫度、延申溫度、循環(huán)數(shù)量過(guò)多有關(guān)。

1、引物特異性可以用NCBI “Primer-BLAST”進(jìn)行分析，確定除了目的序列無(wú)其他結(jié)合位點(diǎn)；

2、設(shè)置PCR程序梯度反應(yīng)，摸索出最佳退火溫度；

3、確定聚合酶的延伸溫度，不同品牌的聚合酶有不同的延伸溫度，要詳細(xì)咨詢廠家技術(shù)；

4、循環(huán)數(shù)適當(dāng)降低，比如開(kāi)始是35個(gè)循環(huán)，可以調(diào)低至30個(gè)循環(huán)。

Q 同一個(gè)小鼠的一個(gè)基因位點(diǎn)鑒定不出來(lái)，其他基因都可以鑒定出來(lái)？
A 若同一個(gè)樣品的DNA模板，其中一個(gè)基因位點(diǎn)擴(kuò)增不出目的條帶，其他基因位點(diǎn)都能擴(kuò)出，說(shuō)明這個(gè)樣品可能是個(gè)多基因修飾的模型組織DNA。

1、需要確定是否為多基因都修飾成功了。比如親本是多基因修飾模型，在繁育過(guò)程中后代基因會(huì)分離和隨機(jī)組合，不一定同時(shí)攜帶了多個(gè)修飾位點(diǎn)；

2、其次，如樣品確定是攜帶多基因修飾的，其他基因能擴(kuò)出來(lái)，證明DNA模板沒(méi)有問(wèn)題，可能是以下兩個(gè)原因：

（1）另一個(gè)基因位點(diǎn)的擴(kuò)增引物不適，比如引物降解了、設(shè)計(jì)不合理等，如果是之前鑒定過(guò)沒(méi)有問(wèn)題的引物，那直接安排重新合成即可；若沒(méi)有擴(kuò)增過(guò)，可以返回查看引物序列是否合理，有問(wèn)題需重新設(shè)計(jì)；

（2）該基因序列相對(duì)其他基因較復(fù)雜，比如高GC、低GC、序列重復(fù)等，需要對(duì)PCR程序調(diào)整，可用touchdown提高擴(kuò)增效率或梯度摸索最佳退火溫度；同時(shí)選用其他擴(kuò)增效率更高的聚合酶；PCR體系中根據(jù)序列特殊性增加DMSO、Mg2+等。

Q 如果人源化小鼠的插入位點(diǎn)是未知的，該如何設(shè)計(jì)引物進(jìn)行鑒定呢?
A 如果人源化小鼠的插入位點(diǎn)未知，那猜測(cè)是個(gè)轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)模型。插入的位點(diǎn)未知，但插入的人源化序列是已知的，可以將引物設(shè)計(jì)在人源化序列上：

1、常規(guī)PCR方法只能區(qū)分陽(yáng)性和陰性，無(wú)法區(qū)分純雜合；

2、如果是基因組人源化，設(shè)計(jì)引物時(shí)需要考慮人源序列與鼠源序列的同源性，將引物設(shè)計(jì)在非同源的人源序列區(qū)域，并且將設(shè)計(jì)好的引物在NCBI “Primer-BLAST”分析，在鼠源基因組上沒(méi)有結(jié)合位點(diǎn)，只結(jié)合人源序列；

3、如果是人源CDS過(guò)表達(dá)，有引入外源啟動(dòng)子等調(diào)控元件，優(yōu)先將引物設(shè)計(jì)在外源元件上，如CAG啟動(dòng)或者polyA上；因此人源化小鼠樣品能擴(kuò)出陽(yáng)性條帶，野生型小鼠無(wú)法條帶。

Q PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)該怎么選擇呢？
A 根據(jù)模板的類型和擴(kuò)增的目的來(lái)區(qū)分，且根據(jù)實(shí)際擴(kuò)增結(jié)果微調(diào)，一般規(guī)則如下：
1、判斷基因型為陽(yáng)性還是陰性：只需通過(guò)跑電泳宏觀分析條帶大小，一般循環(huán)33~38個(gè)；

2、擴(kuò)增的目的條帶需要回收用于測(cè)序：PCR條帶要求亮，產(chǎn)物回收量有要求，循環(huán)設(shè)置在35~38個(gè)；

3、擴(kuò)增的目的條帶需要回收用于質(zhì)粒克隆：擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物保真性要求高，不能有突變或缺失，因此用高保真聚合酶，循環(huán)一般27~30個(gè)循環(huán)；

4、以小鼠基因組DNA作為模板：基因組擴(kuò)增相對(duì)質(zhì)粒更難，模板DNA要求在50~100ng，常用的循環(huán)數(shù)33~38個(gè)；

5、以質(zhì)粒DNA作為模板：擴(kuò)增簡(jiǎn)單，質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)高，模板要求小于1pg，常用循環(huán)數(shù)25~30個(gè)。

Q PCR條帶為150bp以下，電泳條帶非常模糊，有什么好的方法嗎？
A
1、使用TBE電泳緩沖液，相較于TAE，TBE更合適分離小分子DNA片段；

2、瓊脂糖凝膠濃度用3%；

3、只用一排制膠梳子，可用電泳跑道距離足夠大，防止染料擴(kuò)散快導(dǎo)致DNA條帶不夠亮：DNA帶負(fù)電，在電泳中的遷移方向是從負(fù)極-正極，染料帶正電，方向是由正極-負(fù)極；

4、電泳時(shí)，電壓降低，4V/cm，若一個(gè)20cm的電泳槽，電壓可設(shè)置為80V。