動物模型是現(xiàn)代生物醫(yī)學研究中重要的實驗方法與手段，有助于更方便、更有效地認識人類疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和研究防治措施。動物活體成像技術(shù)主要分為光學成像、核素成像、核磁共振成像MRI、計算機斷層攝影CT成像和超聲成像五大類。其中可見光成像和核素成像特別適合研究分子、代謝和生理學事件，稱為功能成像；超聲成像和CT則適合于解剖學成像，稱為結(jié)構(gòu)成像，MRI介于兩者之間。
 

可見光成像是小動物活體實驗最常見的成像方式，包括生物發(fā)光與熒光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶基因標記DNA，利用其產(chǎn)生的蛋白酶與相應底物發(fā)生生化反應產(chǎn)生生物體內(nèi)的光信號。而熒光技術(shù)則采用熒光報告基因或熒光染料等新型納米標記材料進行標記。前者是動物體內(nèi)的自發(fā)熒光，不需要激發(fā)光源，而后者則需要外界激發(fā)光源的激發(fā)。
 

今天帶大家一起來看一下小動物活體成像實驗流程，主要分為三大部分：
一，進行光學標記；
二，構(gòu)建動物模型；
三，活體動物成像

具體細分為：

1、選擇合適的熒光素酶

2、進行載體構(gòu)建

3、建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系

4、細胞注射動物

5、注射底物

6、進行活體成像
 

（1）質(zhì)粒的擴增和純化

制備帶有熒光素luc轉(zhuǎn)酶報告基因或編碼熒光蛋白基因的真核表達質(zhì)粒并進行擴增純化。

（2）細胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的目標細胞，將細胞接種于6孔板內(nèi)，待細胞融合度達到80%～90%孔培養(yǎng)板中，即可轉(zhuǎn)染。進行轉(zhuǎn)染時，將目標細胞、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑及足量的質(zhì)粒載體懸浮液共培養(yǎng)6h，之后補充新鮮的培養(yǎng)液。也可采用Neucleofector電轉(zhuǎn)染的方式，能夠縮短轉(zhuǎn)染時間，獲取更高轉(zhuǎn)染效率的細胞。

（3）單克隆細胞篩選

轉(zhuǎn)染48h后用胰酶消化細胞，以1:6比例接種到6孔板中，同時加入抗生素G418，隨后每2d更換一次培養(yǎng)基并維持G418篩選直至單細胞抗性克隆的出現(xiàn)。分別挑選單一抗性克隆至96孔板，待其逐漸增殖后轉(zhuǎn)入24孔板中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

（4）熒光素酶活性鑒定陽性克隆，篩選穩(wěn)定高表達的細胞株

單一抗性克隆傳代至第五代時用Luciferase Assay System檢測熒光素酶活性。檢測時，各克隆按1×10^5個/孔接種到24孔板，24h后細胞裂解液裂解，12000r，4℃離心10min，收集裂解物，取上清10μl加入96孔白板中，向每孔加入50μl熒光素酶連續(xù)讀底物，停留2s后，取10s的熒光值（RLU），每個克隆設(shè)3個復孔，保留RLU值高的細胞克隆繼續(xù)傳代培養(yǎng)，再過5代后進行熒光素酶活性檢測。保留RLU值維持較高的克隆直至第30代，熒光素酶活性最高的幾個克隆MCF-7-luc即為陽性克隆。將篩選出高效表達，陽性率接近100%的細胞株進行培養(yǎng)。

根據(jù)實驗目的選擇尾靜脈注射、皮下移植、原位移植等方法接種已標記的細胞。

（1）小鼠經(jīng)過麻醉系統(tǒng)被麻醉后放入成像暗箱平臺，軟件控制平臺的升降到一個合適的視野，自動開啟照明燈拍攝第一次背景圖。（為了降低光吸收，建議大家對成像小鼠做脫毛處理）

（2）自動關(guān)閉照明燈, 在沒有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的光，即為生物發(fā)光成像。與第一次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動物體內(nèi)光源的位置，完成成像操作。熒光成像應選擇合適的激發(fā)和發(fā)射濾片，生物發(fā)光則需要成像前體內(nèi)注射底物激發(fā)發(fā)光。

（3）利用軟件完成圖像分析過程。使用者可以方便的選取感興趣的區(qū)域進行測量和數(shù)據(jù)處理及保存工作。當選定需要測量的區(qū)域后，軟件可以計算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，獲得實驗數(shù)據(jù)。