作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的核心成員，抗體在對(duì)付病原體方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在抗體產(chǎn)生過(guò)程中，初級(jí)抗體庫(kù)是通過(guò)V(D)J重排產(chǎn)生的，對(duì)抗原的親和力相對(duì)較低。之后，由AID胞苷脫氨酶啟動(dòng)的體細(xì)胞超突變（SHM）會(huì)在抗體編碼序列中引入突變，提升抗體對(duì)抗原的親和力，從而實(shí)現(xiàn)抗體的親和力成熟。

之前的研究發(fā)現(xiàn)，超突變?cè)诳贵w可變區(qū)的外顯子上并非均勻分布，而是集中在三個(gè)非連續(xù)的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）。早在20世紀(jì)80年代，科學(xué)家們便提出了超突變?yōu)槭裁淳哂衅�好性的�?wèn)題，但四十多年來(lái)，這仍然是一個(gè)謎。

中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心孟飛龍團(tuán)隊(duì)和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所葉菱秀團(tuán)隊(duì)近日在《Cell》雜志上發(fā)表題為“Mesoscale DNA feature in antibody-coding sequence facilitates somatic hypermutation”的論文，揭示了CDR區(qū)域通過(guò)高度柔性的特征引發(fā)高頻突變的分子機(jī)制。這項(xiàng)研究為優(yōu)化抗體發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)新一代的人源化動(dòng)物模型打下了基礎(chǔ)。
 

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員構(gòu)建了攜帶IgV_H-亂序等位基因的小鼠模型以及CDR3序列改變和FR3序列改變的小鼠模型（其中IgV_H-FR3^TAC乘客等位基因小鼠模型由賽業(yè)生物提供）。他們通過(guò)高通量測(cè)序開(kāi)展了體細(xì)胞超突變分析，并在多種底物上開(kāi)展脫氨分析。他們還通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬和多種生化分析來(lái)研究AID與不同底物的相互作用。

技術(shù)路線
01建立體外檢測(cè)抗體基因突變的新體系，發(fā)現(xiàn)AID酶活反應(yīng)重現(xiàn)小鼠抗體基因突變模式
02通過(guò)抗體基因序列的隨機(jī)置換，發(fā)現(xiàn)周?chē)�序列背景決定WRC基序的突變程度
03通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬和多種生化分析，發(fā)現(xiàn)DNA柔性有助于CDR區(qū)域發(fā)生超突變
04柔性序列的引入可將突變“冷區(qū)”轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔?ldquo;熱區(qū)”

研究結(jié)果
1.AID活性和DNA序列本身決定了CDR超突變性
胞苷脫氨酶AID是一種僅含198個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。體外分析表明，AID作用于單鏈DNA底物，且偏好作用于WRC（W=A/T，R=A/G）基序。然而，脫氨酶基序并不能解釋體細(xì)胞超突變的CDR偏好性，因?yàn)橥瑯拥腤RC基序也存在于抗體可變區(qū)內(nèi)的骨架區(qū)（FR），而且廣泛分布在基因組中。這些結(jié)果提示一些中尺度（5-50 bp）水平的元件可以增強(qiáng)特定WRC基序上的超突變。

研究人員從經(jīng)典的生化方法出發(fā)，聯(lián)合高通量測(cè)序技術(shù)，建立了體外檢測(cè)AID脫氨酶活性的新方法（圖1）。他們使用了一段124-nt的單鏈DNA底物，覆蓋小鼠VHB1-8外顯子中的FR3-CDR3序列，這段序列在體內(nèi)表現(xiàn)出WRC突變偏好。他們發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)CDR高突變特征可以在體外AID脫氨酶活分析中完全重現(xiàn)。
 

體外AID脫氨酶活分析重現(xiàn)了體細(xì)胞超突變圖譜^[1]
 

脫氨優(yōu)先順序與AID-ssDNA相互作用有關(guān)^[1]

3.DNA柔性有助于CDR區(qū)域發(fā)生超突變
之后，他們探討了相關(guān)的物理特征，包括poly（dT）和poly（dA）在DNA柔性上的差異，其中poly（dT）最柔韌，而poly（dA）最僵硬。通過(guò)一系列分析，他們發(fā)現(xiàn)AID脫氨酶基序相鄰序列的柔性會(huì)影響AID脫氨酶的活性。中尺度DNA序列的柔性越大，越有利于結(jié)合AID表面的正電荷片區(qū)，進(jìn)而有助于突變的發(fā)生。單鏈DNA的柔性與嘧啶-嘧啶（Py-Py）二核苷酸的含量呈正相關(guān)。

通過(guò)分析抗體基因序列特征，研究人員發(fā)現(xiàn)CDR中的序列特征可能在密碼子或非編碼DNA水平上經(jīng)過(guò)了進(jìn)化選擇。他們發(fā)現(xiàn)CTA和ACT等基序（即TAC相關(guān)基序）在CDR中高度富集。他們將相關(guān)柔性序列插入抗體基因突變低頻區(qū)FR3中，構(gòu)建了序列改變的IgV_H-FR3^TAC乘客等位基因小鼠模型（該模型由賽業(yè)生物提供），發(fā)現(xiàn)柔性序列極大地提高了FR3區(qū)域的突變頻率，可將突變“冷區(qū)”轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔?ldquo;熱區(qū)”。

研究結(jié)論

DNA柔性在抗體基因超突變中的作用^[1]

總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究揭示了CDR區(qū)域發(fā)生高頻突變的分子機(jī)制，其中高密度的WRC基序和中尺度的DNA柔性都有助于CDR區(qū)域發(fā)生超突變。研究結(jié)果表明了抗體編碼序列在指導(dǎo)超突變中的非編碼作用，為設(shè)計(jì)下一代抗體基因人源化動(dòng)物模型奠定了基礎(chǔ)。

原文檢索：
[1]Wang Y, Zhang S, Yang X, et al. Mesoscale DNA feature in antibody-coding sequence facilitates somatic hypermutation. Cell. 2023 May 11; 186(10): 2193-2207. e19. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.03.030