上周四，賽業(yè)生物細(xì)胞工程高級(jí)科學(xué)家翟曉晨博士為大家?guī)�來�?strong>「流式細(xì)胞術(shù)在CAR-T細(xì)胞治療藥物開發(fā)中的應(yīng)用」線上課程，在最后的答疑環(huán)節(jié)，大家提出了許多困擾已久的問題，就讓云課堂小助理帶大家一起回顧一下這些精彩問答吧！

Q:流式細(xì)胞術(shù)操作的具體過程？
A:
1. 方案設(shè)計(jì)：包括確定檢測標(biāo)志物，依據(jù)檢測指標(biāo)表達(dá)特性進(jìn)行配色；
2. 樣本處理：依據(jù)樣本是細(xì)胞還是組織樣本確定樣本的處理方法；
3. 染色：依據(jù)所用抗體的特性和檢測指標(biāo)的特性確定染色順序和染色條件；
4. 上機(jī)檢測：進(jìn)行邏輯設(shè)門，對檢測指標(biāo)進(jìn)行分析。

Q:CAR-T細(xì)胞治療方法需要開展哪些方面的評價(jià)？
A:在臨床前的研究目標(biāo)主要是評估CAR-T細(xì)胞的有效性和安全性，包括體外藥效評價(jià)和體內(nèi)藥效評價(jià)。體外藥效的評價(jià)指標(biāo)主要包括CAR-T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞活性、細(xì)胞因子分泌和CAR-T細(xì)胞增殖等。體內(nèi)藥效主要包括腫瘤生長抑制效果、小鼠生存期延長以及毒副作用評估等。

Q:檢測T細(xì)胞耗竭用什么標(biāo)志物？
A:T細(xì)胞凋亡和活化都有相應(yīng)的指標(biāo)來指示，活化指標(biāo)通常用CD25和CD69兩個(gè)指標(biāo)來檢測；耗竭指標(biāo)包括PD-1、LAG-3、TIM-3和CTLA-4等，其中PD-1是最常檢測的一個(gè)指標(biāo)。

Q:四代釋放免疫檢查點(diǎn)抑制劑的CAR-T細(xì)胞，是否可以用流式來檢測？
A:首先CAR分子的陽性率一般就是通過流式法來檢測，檢測目標(biāo)通常是CAR分子上所帶的標(biāo)簽，如CAR分子有熒光標(biāo)簽EGFP就能通過流式檢測EGFP來指示CAR分子的表達(dá)。其次分泌的免疫檢查點(diǎn)抑制劑也是可以通過流式法來檢測，但必須滿足一些條件，例如免疫檢查點(diǎn)抑制劑上有一些標(biāo)簽例如His標(biāo)簽等，就可以通過透膜流式實(shí)驗(yàn)來檢測；再例如，如果有檢測免疫檢查點(diǎn)抑制劑的抗體也可以通過流式透膜實(shí)驗(yàn)直接對免疫檢查點(diǎn)抑制劑進(jìn)行檢測。

Q:在細(xì)胞因子釋放檢測中，常用哪些方法？
A: 目前檢測細(xì)胞因子的方法有很多。我們常用的方案包括Elisa和CBA方案。Elisa法通常只能實(shí)現(xiàn)樣本中單因子的檢測，因此對多個(gè)因子的檢測就需要更多的樣本量；CBA法可以實(shí)現(xiàn)單次多個(gè)樣本的檢測，對樣本的需求量比較少。