RT-PCR基本原理與實(shí)驗(yàn)步驟及常見問題的處理方案
1概述
反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)，也稱逆轉(zhuǎn)錄PCR，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。其靈敏度比傳統(tǒng)的RNA印跡法高1000〜10000倍，而所需時(shí)間縮短了幾倍。迄今為止，RT-PCR的方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于RNA的構(gòu)造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表達(dá)解析等多種領(lǐng)域。
2 RT-PCR原理
RT-PCR是一種從細(xì)胞RNA (mRNA)中高效靈敏地?cái)U(kuò)增cDNA序列的方法，它由兩大步驟組成：一步是反轉(zhuǎn)錄（RT)，另一步是PCR。獲得總RNA或mRNA后，即可進(jìn)行RT-PCR。首先，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下將RNA(mRNA)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增的基因特異的上下游引物，基因特異的上游引物與cDNA第一鏈退火，在Taq DNA聚合酶作用下合成cDNA第二鏈。再以cDNA第一鏈和第二鏈為模板，用基因特異的上下游引物PCR擴(kuò)增獲得大量的cDNA。反應(yīng)原理圖如下。
4 RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟
4.1 RNA的提取
(1) 50-100mg組織或（5~10)×106個(gè)細(xì)胞，加入1mL Trizol試劑。對(duì)組織來說，需要在勻漿器中勻漿幾分鐘，至組織完全破碎。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞來說，可用移液器上下吹打或勻漿機(jī)破碎細(xì)胞。
(2) 4 ℃、12 000g離心10 min,轉(zhuǎn)移上清。
(3) 上清室溫放置5min，加0.2mL氯-仿，用手或Votex劇振15 s，室溫放置2~3min。
(4) 4℃、11 000 g離心15 min,轉(zhuǎn)移水相。
(5) 水相中加入0.25 mL異丙醇及0.25 mL高鹽沉淀液（0.8mol/L的檸檬酸鈉，1.2mol/L的 NaCl)混勻，室溫放置10min。
(6) 4℃、11000 g離心10 min去上清。
(7) 加1 mL75%乙醇，Votex混勻，4℃、7000g離心5min，去上清。
(8) 沉淀在空氣中干燥5~10 min,用100 μL DEPC水溶解，槍頭吸打幾次，放于 55℃水浴中10min促溶。
(9) 電泳及檢測(cè)OD值，檢定RNA的量及完整性。
(10) RNA放入-70℃保存。
4.2 mRNA的分離
(1) 檢測(cè)起始RNA的量（起始RNA的量應(yīng)小于或等于0.25mg）。將總RNA加入一個(gè)無RNase的1.5 mL Eppendorf管中，加入不含RNase的水至總體積為250 μL。
(2) 加入250μL的Buffer OBB和15μL的Oligotex懸浮液，完全混合溶液。
(3) 樣品溶液放入70℃水浴中保溫3 min。
(4) 從水浴中取出樣品溶液，室溫下放置10min。（這一步允許Oligotex粒子中的Oligo-dT30 和mRNA的poly-A尾巴雜交）
(5) 將樣品溶液以最大速度（14000~18000 g)離心2min以沉淀Oligotex-mRNA 復(fù)合物，用移液器小心除去上清液。
(6) 用渦旋振蕩器（Votex)或移液器將Oligotex-mRNA復(fù)合物沉淀重懸于400 μL或600 μL Buffer OW2中，然后將這些懸液加入到一個(gè)置于1. 5 mL微量離心管中的小離心柱（用于400 μL懸液）或大離心柱（用于600 μL懸液）中，以最大速度離心1 min。
(7) 轉(zhuǎn)移離心柱到一個(gè)新的不含RNA酶的1.5 mL微量離心管中，然后加入400 μL或600 μL Buffer OW2到離心柱中，以最大速度離心1 min，并且棄掉離心液。
(8) 轉(zhuǎn)移離心柱到一個(gè)新的不含RNA酶的1.5mL微量離心管中，加入 20-100 μL Buffer OEB (70℃預(yù)熱）到柱子中，用移液器洗打溶液3~4次以重懸柱子上的Oligotex-mRNA復(fù)合物，以最大速度離心1 min。
(9) 為了獲得最大的產(chǎn)量，再加入20-100 μL Bulfer OEB (70℃預(yù)熱）到柱子中，然后用同樣的方法重懸柱子中的Oligotex-mRNA復(fù)合物，以最大速度離心1min。為了減少洗脫體積，可以將第一次洗脫液重新加熱到70℃后再用來進(jìn)行另一次洗脫。但是如果要獲得最大量的mRNA，則建議還是用新的Buffer OEB來洗脫。
4.3 RT-PCR
(1) 按下列組成配制RT-PCR反應(yīng)液。
（2）以下條件進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。
反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)，也稱逆轉(zhuǎn)錄PCR，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。其靈敏度比傳統(tǒng)的RNA印跡法高1000〜10000倍，而所需時(shí)間縮短了幾倍。迄今為止，RT-PCR的方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于RNA的構(gòu)造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表達(dá)解析等多種領(lǐng)域。
2 RT-PCR原理
RT-PCR是一種從細(xì)胞RNA (mRNA)中高效靈敏地?cái)U(kuò)增cDNA序列的方法，它由兩大步驟組成：一步是反轉(zhuǎn)錄（RT)，另一步是PCR。獲得總RNA或mRNA后，即可進(jìn)行RT-PCR。首先，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下將RNA(mRNA)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增的基因特異的上下游引物，基因特異的上游引物與cDNA第一鏈退火，在Taq DNA聚合酶作用下合成cDNA第二鏈。再以cDNA第一鏈和第二鏈為模板，用基因特異的上下游引物PCR擴(kuò)增獲得大量的cDNA。反應(yīng)原理圖如下。
3 一步法與兩步法RT-PCR
常用的反轉(zhuǎn)錄PCR方法有兩步法（Two-step RT-PCR)和一步法（One-step RT-PCR)兩種。兩者的區(qū)別與特點(diǎn)如下表所示。
常用的反轉(zhuǎn)錄PCR方法有兩步法（Two-step RT-PCR)和一步法（One-step RT-PCR)兩種。兩者的區(qū)別與特點(diǎn)如下表所示。
4 RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟
4.1 RNA的提取
(1) 50-100mg組織或（5~10)×106個(gè)細(xì)胞，加入1mL Trizol試劑。對(duì)組織來說，需要在勻漿器中勻漿幾分鐘，至組織完全破碎。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞來說，可用移液器上下吹打或勻漿機(jī)破碎細(xì)胞。
(2) 4 ℃、12 000g離心10 min,轉(zhuǎn)移上清。
(3) 上清室溫放置5min，加0.2mL氯-仿，用手或Votex劇振15 s，室溫放置2~3min。
(4) 4℃、11 000 g離心15 min,轉(zhuǎn)移水相。
(5) 水相中加入0.25 mL異丙醇及0.25 mL高鹽沉淀液（0.8mol/L的檸檬酸鈉，1.2mol/L的 NaCl)混勻，室溫放置10min。
(6) 4℃、11000 g離心10 min去上清。
(7) 加1 mL75%乙醇，Votex混勻，4℃、7000g離心5min，去上清。
(8) 沉淀在空氣中干燥5~10 min,用100 μL DEPC水溶解，槍頭吸打幾次，放于 55℃水浴中10min促溶。
(9) 電泳及檢測(cè)OD值，檢定RNA的量及完整性。
(10) RNA放入-70℃保存。
4.2 mRNA的分離
(1) 檢測(cè)起始RNA的量（起始RNA的量應(yīng)小于或等于0.25mg）。將總RNA加入一個(gè)無RNase的1.5 mL Eppendorf管中，加入不含RNase的水至總體積為250 μL。
(2) 加入250μL的Buffer OBB和15μL的Oligotex懸浮液，完全混合溶液。
(3) 樣品溶液放入70℃水浴中保溫3 min。
(4) 從水浴中取出樣品溶液，室溫下放置10min。（這一步允許Oligotex粒子中的Oligo-dT30 和mRNA的poly-A尾巴雜交）
(5) 將樣品溶液以最大速度（14000~18000 g)離心2min以沉淀Oligotex-mRNA 復(fù)合物，用移液器小心除去上清液。
(6) 用渦旋振蕩器（Votex)或移液器將Oligotex-mRNA復(fù)合物沉淀重懸于400 μL或600 μL Buffer OW2中，然后將這些懸液加入到一個(gè)置于1. 5 mL微量離心管中的小離心柱（用于400 μL懸液）或大離心柱（用于600 μL懸液）中，以最大速度離心1 min。
(7) 轉(zhuǎn)移離心柱到一個(gè)新的不含RNA酶的1.5 mL微量離心管中，然后加入400 μL或600 μL Buffer OW2到離心柱中，以最大速度離心1 min，并且棄掉離心液。
(8) 轉(zhuǎn)移離心柱到一個(gè)新的不含RNA酶的1.5mL微量離心管中，加入 20-100 μL Buffer OEB (70℃預(yù)熱）到柱子中，用移液器洗打溶液3~4次以重懸柱子上的Oligotex-mRNA復(fù)合物，以最大速度離心1 min。
(9) 為了獲得最大的產(chǎn)量，再加入20-100 μL Bulfer OEB (70℃預(yù)熱）到柱子中，然后用同樣的方法重懸柱子中的Oligotex-mRNA復(fù)合物，以最大速度離心1min。為了減少洗脫體積，可以將第一次洗脫液重新加熱到70℃后再用來進(jìn)行另一次洗脫。但是如果要獲得最大量的mRNA，則建議還是用新的Buffer OEB來洗脫。
4.3 RT-PCR
(1) 按下列組成配制RT-PCR反應(yīng)液。
（2）以下條件進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。
（3）反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液（5-10μL）進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物。如果此PCR產(chǎn)物需要用于以后實(shí)驗(yàn)，必將PCR產(chǎn)物放于-20℃冷凍保存。
5 RT-PCR常見問題解析
一步RT-PCR和兩步RT-PCR方法哪個(gè)更好？應(yīng)該怎么選擇？
一步RT-PCR的最大優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，因此可避免樣品間的交叉污染。但我們的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，在大多數(shù)情況下，應(yīng)首先考慮兩步RT-PCR法，而不是一步RT-PCR法，因?yàn)閮刹絉T-PCR法產(chǎn)物的產(chǎn)量一般高于一步RT-PCR法；此外兩步法具有更大的靈活性，可以分別優(yōu)化RT和PCR兩步反應(yīng)，而無需考慮它們之間的干擾。
RT-PCR以總RNA作為模板還是以mRNA作為模板好？
提取總RNA還是mRNA取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹Ｒ话闱闆r下（如克隆基因或比較不同樣品間基因表達(dá)水平時(shí)），提取總RNA即可作為RT-PCR的模板。這樣可以減少獲得cDNA的實(shí)驗(yàn)步驟，從而減少實(shí)驗(yàn)誤差。另外，分離總RNA要比分離mRNA少用一些試劑，因此更經(jīng)濟(jì)。但是若要構(gòu)建cDNA文庫(kù)，則需要分離mRNA作為模板，以便提高cDNA文庫(kù)的質(zhì)量。
如何保證作為RT-PCR實(shí)驗(yàn)?zāi)０宓目俁NA的數(shù)量和質(zhì)量？
RT-PCR能否成功的關(guān)鍵之一是提取的總RNA的數(shù)量和質(zhì)量。要想保證獲得高質(zhì)量的總RNA,有兩點(diǎn)需要特別注意：
(1) Trizol試劑的選擇。盡管有很多國(guó)內(nèi)公司都提供廉價(jià)的Trizol試劑出售，但還是強(qiáng)烈推薦購(gòu)買質(zhì)量更可靠的Invitrogen等公司的Trizol試劑。
(2) 提取RNA過程，必須特別小心，嚴(yán)格按照要求操作，以防止RNA的降解。
如何防止提取RNA過程中RNA的降解？
主要注意以下幾點(diǎn)：
(1) 實(shí)驗(yàn)過程中使用的玻璃器皿使用前可于180 ℃干烤8h以上，塑料制品要用氯-仿沖洗。焦磷酸二乙酯（DEPC)是RNase酶的強(qiáng)烈抑制劑，RNA提取過程和反轉(zhuǎn)錄過程中所用的水要用DEPC處理。
(2) 操作人員的手是RNase的重要污染源，進(jìn)行RNA實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)始終戴手套，并應(yīng)勤換手套。
(3) 提取的樣品材料應(yīng)盡可能新鮮，如果不能及時(shí)提取RNA，取樣后應(yīng)保存于液氮中。
如何選擇反轉(zhuǎn)錄引物？
兩步法中反轉(zhuǎn)錄引物有Oligo（dT）（12-18個(gè)核苷酸組成）、隨機(jī)六聚寡核苷酸和基因特異引物，可根據(jù)不同的目的選擇不同的引物。Oligo（dT）引物能與哺乳動(dòng)物mRNA的3'端poly（A）尾巴互補(bǔ)，作為一種通用引物用于cDNA第一鏈的合成。隨機(jī)六聚寡核苷酸引物能與RNA模板的許多位點(diǎn)互補(bǔ)，因此，當(dāng)RNA序列很長(zhǎng)（＞3kb)或其中包含很多二級(jí)結(jié)構(gòu)使Oligo (dT)或基因特異引物很難與mRNA互補(bǔ)時(shí)，選擇隨機(jī)六聚寡核苷酸引物不失為一種良策。
基因特異引物能與靶mRNA的某一區(qū)域互補(bǔ)，該引物可用作 PCR反應(yīng)中的下游引物�；蛱禺愐镌诩�(xì)胞內(nèi)靶mRNA含量較低時(shí)較為有用。
當(dāng)用基因特異引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)，需注意引物的濃度和退火溫度。一般而言，用Oligo (dT)獲得的RT-PCR產(chǎn)物特異性比隨機(jī)六寡核苷酸獲得的RT-PCR產(chǎn)物的特異性高。一步法中所用引物為基因特異引物，因此選擇余地比兩步法少。一步RT-PCR中兩條引物的其中一條既應(yīng)在RT中發(fā)揮作用，又應(yīng)在PCR中發(fā)揮作用。為兼顧RT和PCR,引物的退火溫度一般在45~65℃之間。為增加一步RT-PCR產(chǎn)物的量，引物濃度可增加到0.6 μmol/L。引物最好設(shè)計(jì)在離mRNA 3'末端4 kb區(qū)域以內(nèi)，擴(kuò)增長(zhǎng)度小于1.5 kb。
RT-PCR的產(chǎn)物產(chǎn)率很低是什么原因？
可能是因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄cDNA合成效率低，但更多情況下是因?yàn)閏DNA擴(kuò)增效率低。為了驗(yàn)證后者的可能性，可建立一系列PCR反應(yīng)，這些PCR反應(yīng)中加入了不同數(shù)量的模板。 假如染色后的凝膠上呈現(xiàn)不清晰的成片狀的非特異性條帶，這種實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往是在PCR中加入過量的cDNA模板所致。因此，在許多PCR實(shí)驗(yàn)中用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生的cDNA的10%作為模板。在這種情況下，PCR擴(kuò)增階段需要另加模板。具體最適合的模板量，要靠預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。一旦建立了模板的最佳濃度，其他的PCR參數(shù)可用系統(tǒng)的方式如改變 Mg2+濃度和復(fù)性條件來進(jìn)一步優(yōu)化。
上述調(diào)整后RT-PCR的產(chǎn)物產(chǎn)率依然很低，怎么辦？
可依次采取以下步驟：
(1) 通過含有甲醛的瓊脂糖凝膠電泳來檢査RNA的完整性。
(2) 建立含有對(duì)照mRNA、Oligo (dT)引物和放射性元素標(biāo)記示蹤物的檢測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)cDNA的合成效率。
(3) 將不同比例的RNA樣品和對(duì)照樣品混合，通過比較cDNA的產(chǎn)量來檢測(cè)RNA樣品中是否存在抑制劑。
(4) 在繼續(xù)進(jìn)行PCR之前，純化cDNA第一鏈的樣品。
RT-PCR反應(yīng)后，無PCR產(chǎn)物，怎么辦？
首先應(yīng)嚴(yán)格按照說明書要求，進(jìn)行Control反應(yīng)。如果對(duì)照正常，說明實(shí)驗(yàn)操作方面沒有問題。應(yīng)從RNA樣品的純度和添加量、引物的設(shè)計(jì)情況、參考文獻(xiàn)的可信度以及RT-PCR條件的設(shè)定等方面加以考慮；如對(duì)照反應(yīng)不正常，應(yīng)從實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性、實(shí)驗(yàn)器具的處理、PCR儀的條件設(shè)定等方面加以考慮。
有些RT反應(yīng)體系中，不加dNTP混合物，為什么？
由于在這些RT反應(yīng)體系中已經(jīng)加了足夠量的dNTP Mixture，因此在PCR反應(yīng)中，不須再添加dNTP。如果在PCR反應(yīng)時(shí)繼續(xù)添加，雖然PCR反應(yīng)仍可進(jìn)行，但可能會(huì)降低DNA的擴(kuò)增效率。
5 RT-PCR常見問題解析
一步RT-PCR和兩步RT-PCR方法哪個(gè)更好？應(yīng)該怎么選擇？
RT-PCR以總RNA作為模板還是以mRNA作為模板好？
如何保證作為RT-PCR實(shí)驗(yàn)?zāi)０宓目俁NA的數(shù)量和質(zhì)量？
(1) Trizol試劑的選擇。盡管有很多國(guó)內(nèi)公司都提供廉價(jià)的Trizol試劑出售，但還是強(qiáng)烈推薦購(gòu)買質(zhì)量更可靠的Invitrogen等公司的Trizol試劑。
(2) 提取RNA過程，必須特別小心，嚴(yán)格按照要求操作，以防止RNA的降解。
如何防止提取RNA過程中RNA的降解？
(1) 實(shí)驗(yàn)過程中使用的玻璃器皿使用前可于180 ℃干烤8h以上，塑料制品要用氯-仿沖洗。焦磷酸二乙酯（DEPC)是RNase酶的強(qiáng)烈抑制劑，RNA提取過程和反轉(zhuǎn)錄過程中所用的水要用DEPC處理。
(2) 操作人員的手是RNase的重要污染源，進(jìn)行RNA實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)始終戴手套，并應(yīng)勤換手套。
(3) 提取的樣品材料應(yīng)盡可能新鮮，如果不能及時(shí)提取RNA，取樣后應(yīng)保存于液氮中。
如何選擇反轉(zhuǎn)錄引物？
基因特異引物能與靶mRNA的某一區(qū)域互補(bǔ)，該引物可用作 PCR反應(yīng)中的下游引物�；蛱禺愐镌诩�(xì)胞內(nèi)靶mRNA含量較低時(shí)較為有用。
當(dāng)用基因特異引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)，需注意引物的濃度和退火溫度。一般而言，用Oligo (dT)獲得的RT-PCR產(chǎn)物特異性比隨機(jī)六寡核苷酸獲得的RT-PCR產(chǎn)物的特異性高。一步法中所用引物為基因特異引物，因此選擇余地比兩步法少。一步RT-PCR中兩條引物的其中一條既應(yīng)在RT中發(fā)揮作用，又應(yīng)在PCR中發(fā)揮作用。為兼顧RT和PCR,引物的退火溫度一般在45~65℃之間。為增加一步RT-PCR產(chǎn)物的量，引物濃度可增加到0.6 μmol/L。引物最好設(shè)計(jì)在離mRNA 3'末端4 kb區(qū)域以內(nèi)，擴(kuò)增長(zhǎng)度小于1.5 kb。
RT-PCR的產(chǎn)物產(chǎn)率很低是什么原因？
上述調(diào)整后RT-PCR的產(chǎn)物產(chǎn)率依然很低，怎么辦？
(1) 通過含有甲醛的瓊脂糖凝膠電泳來檢査RNA的完整性。
(2) 建立含有對(duì)照mRNA、Oligo (dT)引物和放射性元素標(biāo)記示蹤物的檢測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)cDNA的合成效率。
(3) 將不同比例的RNA樣品和對(duì)照樣品混合，通過比較cDNA的產(chǎn)量來檢測(cè)RNA樣品中是否存在抑制劑。
(4) 在繼續(xù)進(jìn)行PCR之前，純化cDNA第一鏈的樣品。
RT-PCR反應(yīng)后，無PCR產(chǎn)物，怎么辦？
有些RT反應(yīng)體系中，不加dNTP混合物，為什么？
- IC50值的應(yīng)用、檢測(cè)原理測(cè)定方法和數(shù)據(jù)計(jì)算及分析詳解
- 放射性核素RDC在腫瘤診斷與治療中應(yīng)用和發(fā)展前景
- FITC-xtra 異硫氰酸熒光素的優(yōu)勢(shì)及實(shí)驗(yàn)方案步驟
- α-淀粉酶測(cè)定試劑盒 (Ceralpha Method)原理與使用
- 納米管介導(dǎo)的線粒體轉(zhuǎn)移在腫瘤免疫治療研究中的應(yīng)用
- 分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)在藥物研發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用前景及核心原理
- 紅霉素MTS藥敏紙條助力抗擊耐藥精準(zhǔn)檢測(cè)
- 大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)試劑盒使用說明書
- 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)2025全國(guó)學(xué)術(shù)大會(huì)招商函
- MCE推出生命科學(xué)文獻(xiàn)有投必獎(jiǎng)活動(dòng)(腫瘤與癌癥)
- 睿通生物推出新品ML19熔融石英折射率匹配液
- MCE直播：同位素標(biāo)記物示蹤劑與定量?jī)?nèi)標(biāo)品的探索
- MCE邀您參加2024年滿意度有獎(jiǎng)?wù){(diào)查&感恩節(jié)回饋活動(dòng)
- MCE暖冬鉅惠：染料、siRNA65折，享1.5倍牌價(jià)積分
- MCE中國(guó)11月展會(huì)預(yù)告: 蘇州生物藥創(chuàng)新開發(fā)峰會(huì)等
- MCE直播：癌癥中的炎癥反應(yīng)&細(xì)胞焦亡的思路與方法
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com