話說線粒體自噬，可謂是大家眼中的“老大哥”了。往期小 M 為大家介紹過自噬的分類，底物以及檢測 (詳見往期推文：Hello~自噬；還能這么玩兒？跟大牛解鎖自噬檢測)，今天小 M 帶大家進一步了解線粒體自噬的經(jīng)典機制以及檢測方法~

 

線粒體，作為一種雙層膜半自主細胞器，它是細胞中制造能量的結(jié)構(gòu)，是細胞有氧呼吸和利用氧化磷酸化產(chǎn)生 ATP 的場所的主要場所。其 “大佬” 地位毋庸置疑，但它的功能狀態(tài)與線粒體膜電位、線粒體膜通道、線粒體 Ca²⁺ 濃度、呼吸鏈復合體活性、活性氧生成以及 DNA 突變密切相關(guān)。線粒體質(zhì)量控制通過蛋白質(zhì)平衡、線粒體自噬、動力學和生物發(fā)生等方式的協(xié)調(diào)來維持線粒體的完整性和功能。 
 
■ 什么時候發(fā)生線粒體自噬？

線粒體自噬 (Mitochondrial autophagy, mitophagy) 作為一種重要線粒體質(zhì)量控制機制，在活性氧 (ROS) 脅迫等應激作用下，會導致線粒體 DNA (Mitochondrial DNA, mtDNA) 突變逐漸累積，還會使細胞內(nèi)線粒體膜電位降低和去極化損傷，并最終導致細胞死亡^[1][2]。嚴峻的生存形勢下，線粒體只好 “大開殺戒”，為了維持線粒體和細胞穩(wěn)態(tài)，防止受損線粒體損傷細胞，細胞通過選擇性地包裹和降解細胞內(nèi)受損或功能障礙的線粒體--即線粒體自噬。

既然被吃已然是定局，那么受損線粒體是如何被 “干掉” 的？這一過程與巨自噬有著很大的相似性，但它更像是細胞器的選擇性自噬去除。

線粒體自噬主要有以下 4 個關(guān)鍵步驟：1) 受損線粒體去極化，失去膜電位。2) 線粒體被自噬體包裹形成線粒體自噬體。3) 線粒體自噬體與溶酶體融合。4) 線粒體內(nèi)容物被溶酶體降解。溶酶體或液泡酸性水解酶流入自噬體降解受損線粒體。

 

 
線粒體自噬的機制通常分為兩類: 泛素依賴途徑和非泛素依賴途徑。
■ 泛素依賴性途徑
花開兩朵，各表一枝。首先，我們來看一看泛素依賴性途徑，顧名思義，依賴于線粒體表面蛋白的廣泛泛素化來促進線粒體自噬。目前研究最廣泛的便是 PINK1/Parkin 通路。在這一機制中，PTEN 誘導的激酶 1 (PTEN induced kinase 1, PINK1) 堪稱線粒體自噬的得力助手。當線粒體膜電位 (Mitochondrial membrane potential, MMP, ΔΨm) 受損時，PINK1 進入線粒體內(nèi)膜的途徑受阻，導致 PINK1 在線粒體外膜的胞質(zhì)面上穩(wěn)定聚集。同時，這會募集并激活 Parkin，Parkin 蛋白酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變，轉(zhuǎn)化為活化的 E3 泛素連接酶，然后泛素化線粒體上的蛋白質(zhì)^[3]。PINK1 與 Parkin 相互作用，共同調(diào)控線粒體自噬過程以維持線粒體質(zhì)量 (圖 2)。此外，除了 PINK1-Parkin 通路之外，還有非 Parkin 依賴性的泛素依賴性通路。也就是說，PINK1 還可以通過泛素磷酸化直接招募自噬受體蛋白 (如 NIX、BNIP3 和 FUNDC1) 到線粒體，受體蛋白募集 LC3，這使得自噬體能夠吞噬線粒體。 

 

圖 2. 線粒體自噬機制概述^[1] 

線粒體自噬的 Ub 依賴途徑 (PINK1/Parkin 通路最為常見) 和 Ub 非依賴性途徑

 

■ 非泛素依賴性途徑
盡管據(jù)了解 PINK1 和 Parkin 的激活可以觸發(fā)線粒體自噬，但線粒體自噬也可能通過其他機制進行：相比之下，非泛素依賴途徑就略顯 “清閑”，線粒體外膜 (OMM)
上有許多包含 LC3 相互作用區(qū) (LIR) 區(qū)域的蛋白，它們是自噬的受體。它們可以不經(jīng)泛素化直接與 LC3 結(jié)合，從而啟動線粒體自噬(圖 2)。在哺乳動物中，這些受體主要包括 Nip3 樣蛋白 X (Nip3-like protein X, NIX) 受體、bcl2 相互作用蛋白 3 (BCL2-interacting protein 3, BNIP3) 受體、FUN14 結(jié)構(gòu)域包含 1 (FUN14 domain containing 1, FUNDC1) 受體
 
 

■ 線粒體自噬的相關(guān)疾病

正常的線粒體活動對細胞功能至關(guān)重要，及時的消除受損線粒體是細胞的自我保護機制。當線粒體自噬發(fā)生障礙可觸發(fā)多種疾病，如：線粒體功能障礙是阿爾茨海默氏癥，帕金森氏癥，亨廷頓氏癥等神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵共同因素，PINK1 和 Parkin 的功能缺失突變與家族性帕金森病相關(guān)。心肌細胞的活動高度依賴于線粒體的能量供應，線粒體吞噬功能障礙可引起心肌肥厚、心律失常、心源性猝死等心血管疾病[6]。

 

 

線粒體自噬是一個復雜的、動態(tài)的過程，檢測方法也在不斷的更新，小 M 以文獻為例，盤點常見的線粒體自噬研究方法！ 

 

Myoferlin 是一種在多種癌癥中過度表達的癌蛋白，已有報道表明 Myoferlin 通過與線粒體動態(tài)機制的相互作用對胰腺癌的線粒體適應性有顯著貢獻^[7]。為證明 Myoferlin 在 PDAC 細胞系中對線粒體自噬的影響，研究者使用了 
WJ460 處
理 PDAC 細胞并進行線粒體形態(tài)觀察，如圖所示 WJ460 處理導致線粒體嵴結(jié)構(gòu)紊亂，甚至出現(xiàn)空白區(qū)域 
(圖 4a)。研究者還進行了對自噬體和線粒體進行了免疫定位：WJ460 處理的癌細胞中自噬體的數(shù)量增加，并且在 BxPC-3、Panc-1 和 PaTu 8988T 細胞系中發(fā)現(xiàn)了共定位點 (圖 4b)。此外，PDAC 在  WJ460 處理后，線粒體 ROS 豐度顯著降低 (圖 4c)。以上表明，在 PDAC 細胞系中，Myoferlin 的靶向抑制引起線粒體能量應激，并引發(fā)線粒體自噬。

圖 4. WJ460 在 PDAC 細胞誘導線粒體自噬^[7] 

a. 電鏡下觀察線粒體狀態(tài)。b. 免疫熒光共定位。c. 活性氧檢測

 
 
除上述線粒體形態(tài)觀察 (透射電鏡下線粒體受損情況)，ROS 濃度測定線粒體內(nèi)活性氧的積累，自噬體與線粒體免疫熒光共定位等方法，線粒體自噬的相關(guān)追蹤探針以及線粒體自噬標志物的 Western 檢測以及也是常用的檢測線粒體吞噬的方法^[8]。如，在今年發(fā)表的A mitochondrial SCF-FBXL4 ubiquitin E3 ligase complexdegrades BNIP3 and NIX to restrain mitophagy and prevent mitochondrial disease 一文報道了關(guān)于線粒體自噬調(diào)控和線粒體疾病的研究。研究發(fā)現(xiàn)，在線粒體疾病 MTDPS13 中突變的蛋白 FBXL4 定位在線粒體外膜并發(fā)現(xiàn) FBXL4 負調(diào)控線粒體自噬，抑制線粒體自噬的過度激活。作者團隊使用 mtKeima 報告基因分析了線粒體吞噬， mtKeima 是一種針對線粒體基質(zhì)的 ph 敏感蛋白熒光蛋白，Keima 的激發(fā)光譜會隨 pH 值而變化（圖 5a)。

短波長在中性環(huán)境中的激發(fā)，而長波長會酸性環(huán)境激發(fā)，可用于區(qū)分游離線粒體和線粒體溶酶體。

 

圖 5. FBXL4-KO在HeLa細胞誘導線粒體自噬^[9] 

a. 探針追蹤機制的示意圖。b. 免疫熒光共定位

 

當線粒體被溶酶體吞噬時，Keima 會處在酸性環(huán)境，如圖在 Merged 圖中，黃綠色的 mtKeima 信號標記細胞質(zhì)內(nèi)的線粒體，紅色的 mtKeima 信號標記溶酶體內(nèi)的線粒體自噬。FBXL4-KO 導致線粒體數(shù)量過少，激活了線粒體自噬。自噬過程中，參與線粒體自噬的蛋白 (PINK1、Parkin、BNIP3、Nix、FUNDC1) 水平在線粒體吞噬被激活后會增加。如圖 7 所示， Fbxl4-/-小鼠的組織樣本檢測出標記物蛋白 BNIP3 和 NIX 的積累、過度線粒體自噬和線粒體數(shù)量減少。

 

圖 6. Fbxl4-/- 小鼠組織樣本的Western 檢測^[9]  

■ 小結(jié)

線粒體自噬可謂是非“吃”不可，方式也是多種多樣，除了泛素依賴途徑 (PINK1/Parkin 通路為主) 和非泛素依賴途徑的經(jīng)典機制。小M 還給大家介紹了線粒體自噬的一些常見檢測方法，希望能幫助到小伙伴們！ 

 
 

相關(guān)產(chǎn)品

Rotenone 線粒體電子傳遞鏈復合物 I 抑制劑。Rotenone 通過促進線粒體活性氧的產(chǎn)生來誘導細胞凋亡 。

FCCP 線粒體中氧化磷酸化 (OXPHOS) 解偶聯(lián)劑。FCCP 誘導 PINK1 激活，促進 Parkin 在 Ser65 位點磷酸化。

Oligomycin A 線粒體 F0F1-ATPase 抑制劑，Oligomycin A 具有抗真菌的功能。

Mdivi-1 選擇性的發(fā)動蛋白相關(guān)蛋白 1 (Drp1) 抑制劑。Mdivi-1 是一種有效的線粒體分裂/線粒體自噬 (mitophagy) 抑制劑。

Urolithin A 鞣花酸的腸道微生物代謝產(chǎn)物，具有抗炎、抗增殖和抗氧化的特性。Urolithin A 誘導自噬和凋亡，抑制細胞周期進程，抑制 DNA 合成。

Salidroside 通過增強 PINK1/Parkin 介導的線粒體自噬來保護多巴胺能神經(jīng)元。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務
 
 

參考文獻

 

 

[1] Lu Y, et al. Cellular mitophagy: Mechanism, roles in diseases and small molecule pharmacological regulation. Theranostics. 2023;13(2):736-766.
 
[2] Lemasters JJ. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Rejuvenation Res. 2005;8(1):3-5. 
 
[3] Riley BE, Lougheed JC, Callaway K, et al. Structure and function of Parkin E3 ubiquitin ligase reveals aspects of RING and HECT ligases. Nat Commun. 2013;4:1982.
 
[4] Lazarou M, Sliter DA, Kane LA, et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 2015;524(7565):309-314. 
 
[5] Vargas JNS, Wang C, Bunker E, et al. Spatiotemporal Control of ULK1 Activation by NDP52 and TBK1 during Selective Autophagy. Mol Cell. 2019;74(2):347-362.e6.
 
[6]  Qiu Y, Wang J, Li H, et al. Emerging views of OPTN (optineurin) function in the autophagic process associated with disease. Autophagy. 2022;18(1):73-85. 
 
[7] Gilles Rademaker, et al. Myoferlin targeting triggers mitophagy and primes ferroptosis in pancreatic cancer cells. Redox Biol. 2022 Jul;53:102324. 
 
[8] Tan HWS, Lu G, Dong H, et al. A degradative to secretory autophagy switch mediates mitochondria clearance in the absence of the mATG8-conjugation machinery. Nat Commun. 2022;13(1):3720. Published 2022 Jun 28. 
 
[9]. Yu Cao, Jing Zheng, Huayun Wan, et al. A mitochondrial SCF-FBXL4 ubiquitin E3 ligase complex degrades BNIP3 and NIX to restrain mitophagy and prevent mitochondrial disease. EMBO J. 2023 Mar 10;e113033.  
 
[10] Han R, Liu Y, Li S, Li XJ, Yang W. PINK1-PRKN mediated mitophagy: differences between in vitro and in vivo models [published online ahead of print, 2022 Nov 3]. Autophagy. 2022;1-10. 
 
[11]  Wang X, Winter D, Ashrafi G, et al. PINK1 and Parkin target Miro for phosphorylation and degradation to arrest mitochondrial motility. Cell. 2011;147(4):893-906. 
 
[12]  Huang E, Qu D, Huang T, et al. PINK1-mediated phosphorylation of LETM1 regulates mitochondrial calcium transport and protects neurons against mitochondrial stress. Nat Commun. 2017;8(1):1399. Published 2017 Nov 9. 
 
[13]  Yang W, Liu Y, Tu Z, et al. CRISPR/Cas9-mediated PINK1 deletion leads to neurodegeneration in rhesus monkeys. Cell Res. 2019;29(4):334-336. 
 
[14] Yang W, Guo X, Tu Z, et al. PINK1 kinase dysfunction triggers neurodegeneration in the primate brain without impacting mitochondrial homeostasis. Protein Cell. 2022;13(1):26-46. 

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