上述分子的體現(xiàn)了降解劑的結(jié)構(gòu)與應(yīng)用類(lèi)型的豐富性，但降解劑類(lèi)分子的合理設(shè)計(jì)與不斷優(yōu)化以及活性檢測(cè)仍有很長(zhǎng)的路要走。
 

前文我們已經(jīng)介紹過(guò)，PROTAC 分子的設(shè)計(jì)之初，靶蛋白配體、E3 連接酶配體和兩者中間的連接子三者應(yīng)該分別考量。

 

在 PROTAC 介導(dǎo)的蛋白降解途徑中，其中靶標(biāo)配體 (POI)-PROTAC-E3 連接酶等三元復(fù)合物的有效形成同樣起到重要作用。三元復(fù)合物的任一單元的濃度改變帶來(lái)的不僅僅是線性變化，“鐘” 形模型常常被用來(lái)解釋這樣的活性與濃度相關(guān)性，文獻(xiàn)中提及的 hook effect 也正是形容這種情形。

 

另外，在活性研究中，協(xié)同效應(yīng) (cooperativity, α) 這一詞匯，被用于解釋 PROTAC 受 POI 與 E3 連接酶配體間蛋白蛋白相互作用 (PPI) 的影響。當(dāng) α 大于 1 時(shí)，POI 和 E3 是正協(xié)同效應(yīng)，對(duì)三元復(fù)合物的形成有利。

 

圖 1. PROTAC 降解能力的“鐘”形模型與協(xié)同效應(yīng)示意圖^[1]

 

 

1. 依賴(lài)溶酶體途徑的降解類(lèi)分子

PROTAC 主要依賴(lài)泛素-蛋白酶體途徑，其對(duì)應(yīng)降解的大多為胞質(zhì)蛋白與核蛋白。Bertozzi 教授的研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一項(xiàng)靶向胞外蛋白的降解技術(shù)——溶酶體靶向嵌合體 (LYTAC)。已證明 LYTAC 成功降解了表皮生長(zhǎng)因子受體 (EGFR)、程序性死亡配體 1 (PD-L1) 等膜上蛋白。
 
對(duì)于細(xì)胞中一些非蛋白成分，Targeting lipid droplets for autophagic degradation by ATTEC 一文展示了一種通過(guò)自噬束縛化合物 (ATTECs) 降解非蛋白質(zhì)生物分子的新策略，使用脂滴作為示例靶標(biāo)并成功降解。

 
但不論是 PROTAC 還是上述其他方式，它們都靶向真核生物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解，均不能在細(xì)菌和其他原核生物中發(fā)揮功能。
 
2. 依賴(lài) ClpCP 酶的 BacPROTAC

今年 6 月，Morreale 團(tuán)隊(duì)等人在 Cell  發(fā)表的 BacPROTACs mediate targeted protein degradation in bacteria 一文報(bào)道了一種用于革蘭氏陽(yáng)性菌和分枝桿菌靶向蛋白降解的創(chuàng)新技術(shù)，BacPROTAC。

 

他們基于 Clausen 實(shí)驗(yàn)室之前的一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)：在枯草芽孢桿菌和其他革蘭氏陽(yáng)性菌中，AAA 去折疊酶 ClpC 和蛋白酶 ClpP 組成的 ClpC–ClpP (ClpCP) 蛋白酶是降解細(xì)菌中未折疊和聚集蛋白質(zhì)的重要蛋白水解酶。由于磷酸精氨酸的對(duì)接位點(diǎn)位于 ClpC ATP 酶的氨基末端結(jié)構(gòu)域，磷酸精氨酸 (pArg) 可作為 ClpCP 蛋白酶復(fù)合體的降解標(biāo)簽。

 

Morreale 等人報(bào)道的細(xì)菌 PROTACs (BacPROTACs) 由 POI 配體、Linker 和 ClpC_NTDs 配體組成，可誘導(dǎo)細(xì)菌這種沒(méi)有泛素蛋白酶體的非真核生物蛋白的體內(nèi)外降解。如圖 3A，研究團(tuán)隊(duì)在體外首先以單體鏈霉親和素 (mSA) 作為模型蛋白，通過(guò) BacPROTAC 將 pArg (ClpC_NTD 配體) 與生物素 (mSA 的配體) 結(jié)合，形成 BacPROTAC-1 三元復(fù)合物，有效降解靶蛋白。BacPROTAC-1 與 mSA 和 ClpC_NTD 結(jié)合的 K_D 為 3.9 和 2.8 μM (如圖 3C)。

 

 

圖 3. BacPROTAC-1 對(duì)枯草芽孢桿菌 ClpCP 的體外重編程^[6]

 

由于磷精氨酸的化學(xué)穩(wěn)定性等方面存在問(wèn)題，在體內(nèi)的應(yīng)用有限。作者團(tuán)隊(duì)將內(nèi)源性的磷酸化精氨酸殘基 (pArg) 換成了高選擇性的 sCym-1。sCym-1 不但可以和枯草芽孢桿菌的 ClpCP 結(jié)合，還可以與分歧桿菌的 ClpC1P1P2 結(jié)合。

 

 

 
由于細(xì)胞生物素會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性與 mSA 結(jié)合，一定程度上阻礙 BacPROTAC 活性 (圖 5)，作者團(tuán)隊(duì)確定以 Bromodomain-1 (BD1) 作為更吸引人的模型底物，并將 JQ1 作為新的POI配體，天然環(huán)素 dCymM  作為 ClpC_NTD 結(jié)合基團(tuán)。BacPROTACs 以濃度依賴(lài)性的方式促進(jìn) BRDT_BD1 的降解。
 

圖 5. BacPROTACs 可以對(duì)分枝桿菌 ClpC1P1P2 進(jìn)行重編程^[6]

上：BRDTBD1-directed BacPROTACs: 通過(guò)不同的 Linker 和連接位點(diǎn)連接 JQ1 到dCymM。下：分枝桿菌 ClpC1P1P2 與 BD1 孵育后降解的 SDS-PAGE 分析。

 

總之，如圖 6 所示：PROTACs 通過(guò)招募 E3 連接酶來(lái)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)降解，E3 連接酶使得靶蛋白貼上泛素化標(biāo)簽，最后蛋白酶體降解泛素化的蛋白質(zhì)。

BacPROTACs 以高度特異的方式將細(xì)菌 ClpCP 蛋白酶定向到底物上，它不但可以誘導(dǎo)底物和蛋白酶之間的接近，并且通過(guò)結(jié)合誘導(dǎo)無(wú)活性的 ClpCP 十聚體重組為有活性的六聚體形式，直接啟動(dòng) ClpCP 水解靶標(biāo)蛋白。

 

圖 6. 蛋白質(zhì)降解的異雙功能方法^[5]

   

在降解劑分類(lèi)里，分子膠 (Molecular glues) 指同樣發(fā)揮誘導(dǎo)蛋白降解作用卻無(wú) Linker 連接的一類(lèi)分子，如Thalidomide、CC-92480、CC-90009 等結(jié)構(gòu)。分子膠在結(jié)構(gòu)上更接近傳統(tǒng)小分子,在膜透過(guò)性和生物利用度上更具優(yōu)勢(shì)，是 PROTAC 型降解劑的一個(gè)改造方向。

 

 

 

降解劑的最終目的是降解相關(guān)的蛋白， 無(wú)論是依賴(lài)泛素酶途徑的 PROTAC，依賴(lài)蛋白酶體途徑的 LYTAC，依賴(lài) (ClpCP) 蛋白酶的 BacPROTAC。除 Kd 值測(cè)定之外，Western Blot 實(shí)驗(yàn)在驗(yàn)證蛋白降解方面更為直觀，因此常常被用于 PROTAC 類(lèi)分子活性的測(cè)試。

 

 

 
PROTAC 已經(jīng)衍生出一類(lèi) “POI 配體-Linker-降解系統(tǒng)導(dǎo)向物” 模式的分子，這類(lèi)分子補(bǔ)足了 PROTAC 作為降解劑在某些蛋白與非蛋白分子降解上的不足，賦予了降解劑這一概念更多的可能性。除了分子自身作用機(jī)制帶來(lái)活性測(cè)試結(jié)果上與常規(guī)分子的差異，合適的降解途徑對(duì)活性的影響尤其巨大。 
 
MCE 是全球前沿的科研化學(xué)品和生物活性化合物供應(yīng)商，可以為科學(xué)家提供 PROTAC 類(lèi)相關(guān)產(chǎn)品，目前我們已有 PROTAC、AUTAC、ATTEC、分子膠以及它們的構(gòu)成模塊等各種產(chǎn)品在線。同時(shí)，我們還提供 PROTAC 類(lèi)產(chǎn)品的一體化合成服務(wù)。

 
MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。

 

參考文獻(xiàn)

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