牙齒是我們最最親密的老友，幾乎陪伴我們一生。它是人體里最堅(jiān)硬的器官，幫助我們把食物切碎、研磨，在吞咽食物前將食物加工成更適合胃消化的大小和狀態(tài)，從而讓我們更好的吸收食物中的營養(yǎng)，保持健康。雖然它很“強(qiáng)硬”，但也有“脆弱”的一面，由于牙髓內(nèi)含有豐富的感覺神經(jīng)末梢，當(dāng)牙齒遭遇危機(jī)時(shí)，可能會(huì)引起劇烈的疼痛，所以人們常說：“牙疼不是病，疼起來真要命。”

健康從“齒”開始，請(qǐng)呵護(hù)牙齒健康，關(guān)注牙齒的重要寶藏資源——牙髓干細(xì)胞。
 

牙齒與DPMSCs

牙齒的構(gòu)造從上到下主要分為牙冠、牙頸、牙根，從外到內(nèi)主要分為牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)、牙髓，其中牙髓外部為一層造牙本質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)部還有神經(jīng)、血管，淋巴和結(jié)締組織，正是因?yàn)檠浪杞M織的這種構(gòu)造，使我們的牙齒在遭受到外界過冷、過熱、外力損傷、壓力刺激等不利于身體正常生理活動(dòng)的情況下，能迅速預(yù)警傳遞給大腦從而發(fā)生反應(yīng)；當(dāng)牙齒受損時(shí)，牙髓內(nèi)部還存有一種可隨時(shí)待命的間充質(zhì)干細(xì)胞，他會(huì)分化為損傷組織細(xì)胞從而修復(fù)損傷，或通過分泌多種因子促進(jìn)傷口愈合降低炎癥反應(yīng)等等。

這種牙髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在2000年，由Gronthos等科學(xué)家發(fā)現(xiàn)并分離出來，他與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有非常相似的表面標(biāo)記物，及形成礦化結(jié)節(jié)的能力，科學(xué)家根據(jù)他的來源命名為牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Dental Pulp Mesenchymal Stem Cells, DPMSCs)。

我們每個(gè)人都有牙齒，牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的來源獲取十分便利，沒有倫理爭(zhēng)議，且他作為間充質(zhì)干細(xì)胞本身的干性和作用也毫不遜色，在牙齒及頜骨組織的再生修復(fù)、口腔以外組織的再生修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等多種治療中具有廣闊前景。
 

人下頜第一磨牙(a–c)和人股骨(d, e)以及牙髓結(jié)構(gòu)(f)之間的對(duì)比       
 

DPMSCs分離培養(yǎng)

材料準(zhǔn)備

• 樣本：兒童乳牙或成人智齒，采集時(shí)間＜12小時(shí)，樣本保存液：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+1%雙抗10mL，保存溫度4℃。

• 試劑：OriCell^®PBS、OriCell^®人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基、OriCell^®Collagenase Type I (0.1%) 一型膠原蛋白酶、OriCell^®胰蛋白酶細(xì)胞消化液（0.25%）、中性蛋白酶。

• 耗材：50mL無菌采集瓶一個(gè)、50mL離心管5-10個(gè)、10mL移液管4個(gè)、T25培養(yǎng)瓶若干個(gè)。

• 器械：小型手持打磨機(jī)、配小齒輪、拔髓針一套（含多種型號(hào)）、牙鉗、止血鉗、眼科剪。
   

牙髓組織獲取

1.1 取兒童乳牙或成年阻生智齒，用小型手持打磨機(jī)配滅菌小齒輪在培養(yǎng)皿中縱向或橫向?qū)⒀拦谇械�，用拔髓針取出牙髓組織。

1.2 將取出的牙髓組織放入1.5mL ep管中。用OriCell^®PBS潤(rùn)洗培養(yǎng)皿2-3次，收集潤(rùn)洗液，轉(zhuǎn)移進(jìn)1.5mL ep管中。

牙髓組織消化

2.1 用眼科剪適當(dāng)剪碎牙髓組織，消化液配制終濃度為膠原酶Ⅰ型（3mg/mL）：中性蛋白酶（4mg/mL）=1:1；使用1-2倍體積的消化液與牙髓組織混勻，置于搖床37℃消化1小時(shí)。

2.2 輕輕吹打組織塊，使細(xì)胞離散成單個(gè)細(xì)胞懸液。OriCell^®PBS洗滌1-2遍，挑出沒有消化掉的組織放入T25培養(yǎng)瓶底部貼壁靜置，細(xì)胞懸液室溫250×g，6min離心，去上清。

2.3 用OriCell^®人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基3mL重懸細(xì)胞，輕輕接種于裝有牙髓組織塊的T25培養(yǎng)瓶中，盡量不要使已貼壁的組織塊漂浮起來，將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中37℃，5%CO₂條件培養(yǎng)。24h后觀察細(xì)胞，看細(xì)胞是否有貼壁和污染現(xiàn)象。

換液操作

2.4. 原代接種第3天進(jìn)行第一次半量換液。

2.5. 輕輕將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基倒入50mL離心管中，250×g，6min離心。

2.6. T25培養(yǎng)瓶中加入離心完畢的1.5mL舊培養(yǎng)基，1.5mL新OriCell^®人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，半量換液完畢。

2.7. 將培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱中。

2.8. 完成第一次換液后每隔3天進(jìn)行一次半量換液(可以根據(jù)生長(zhǎng)情況適當(dāng)調(diào)整)，半換液直到細(xì)胞匯合度達(dá)到可傳代為止。

傳代培養(yǎng)

（P0傳P1與P1后傳代的操作方法流程一致）

2.9. 將完全培養(yǎng)基、PBS、胰酶預(yù)熱至37℃。

3.0. 吸去培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基。用OriCell^®PBS(T25培養(yǎng)瓶加入約3mL，T25培養(yǎng)瓶加入約3mL)洗滌細(xì)胞2次，注意動(dòng)作輕柔，清洗全面。吸去PBS。

3.1. 加入OriCell^®胰酶(T25培養(yǎng)瓶加入約1.5 mL，T75培養(yǎng)瓶加入約3mL)，迅速鋪勻，保證充分接觸細(xì)胞表面。

3.2. 顯微鏡下觀察消化情況，約70%~80%細(xì)胞收縮變圓后，輕拍培養(yǎng)容器外壁，使細(xì)胞脫離培養(yǎng)表面。立即加入OriCell^®人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基(T25培養(yǎng)瓶加入約3mL，T75培養(yǎng)瓶加入約6mL)，隨即輕搖培養(yǎng)容器，使培養(yǎng)基和胰酶迅速混勻，終止消化。

3.3. 使用吸管或移液管吸取細(xì)胞懸液，吹打培養(yǎng)容器底面數(shù)次，盡可能將細(xì)胞都吹打下來。

注意：吹打動(dòng)作不可劇烈，避免產(chǎn)生大量氣泡，否則可能損傷和損失細(xì)胞。

3.4. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中。用OriCell^®PBS(T25培養(yǎng)瓶加入約3mL，T75培養(yǎng)瓶加入約6mL)洗滌容器1次，收集殘留細(xì)胞。

3.5. 收集的所有細(xì)胞懸液以250×g，離心4min。

3.6. 離心后去除上清。加入2mL OriCell^®人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，輕柔吹打細(xì)胞沉淀，充分吹散、混勻。將細(xì)胞按(2.5~4)×10⁴個(gè)活細(xì)胞/cm²接種至適宜的培養(yǎng)容器內(nèi)。

注意：培養(yǎng)牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞密度有較高的要求，我們建議有條件且計(jì)數(shù)效率較高的情況下，進(jìn)行手工計(jì)數(shù)，以期獲得精準(zhǔn)的細(xì)胞濃度指導(dǎo)接種;在沒有精確計(jì)數(shù)條件的情況下，按照適宜比例傳代是更好的方法。通常牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代比例為1:3，72h內(nèi)生長(zhǎng)至可傳代匯合度。請(qǐng)根據(jù)細(xì)胞實(shí)際生長(zhǎng)情況調(diào)整傳代比例。

3.7. 搖勻細(xì)胞，放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱中。
3.8. 傳代次日，觀察細(xì)胞狀態(tài)。若發(fā)現(xiàn)較多漂浮細(xì)胞，應(yīng)予以換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合，即需傳代或凍存。

注意：正常情況下牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞每代生長(zhǎng)時(shí)間不超過72h，中途不需要換液，頻繁換液會(huì)破壞構(gòu)建起的細(xì)胞微環(huán)境。