1.組織透明化極大地改善了哺乳動(dòng)物組織中的化學(xué)標(biāo)記

作者對(duì)小鼠給藥脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）抑制劑PF7845-yne（末端含炔基），通過(guò)CuAAC點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，炔基與熒光標(biāo)簽的疊氮化物反應(yīng)形成疊氮炔環(huán)，進(jìn)而引入熒光基團(tuán)。初始試圖直接成像藥物結(jié)合的FAAH，但由于信噪比較差，未能顯示細(xì)胞靶標(biāo)。因而猜測(cè)腦組織構(gòu)成復(fù)雜，其致密的脂膜可能影響點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，作者測(cè)試了基于聚丙烯酰胺的水凝膠組織透明化方法CLARITY，結(jié)果發(fā)現(xiàn)去除脂質(zhì)后顯著提升了成像的信噪比（圖1C、D）。作者同時(shí)也驗(yàn)證了其他的透明化方法也得到了類似的效果（圖1E）。此外，作者還比較了不同的點(diǎn)擊化學(xué)配體（TBTA，BTTAA，BTTP）及不同的銅離子濃度下的反應(yīng)效率，發(fā)現(xiàn)使用BTTP，150 μM硫酸銅條件下可獲得高信噪比且穩(wěn)定的成像（圖1B）。

2.CATCH實(shí)現(xiàn)了藥物-靶點(diǎn)接觸的全腦、亞細(xì)胞原位成像

為了驗(yàn)證CATCH應(yīng)用的廣泛性，作者對(duì)三種小分子藥物FAAH抑制劑PF7845-yne、BIA10-2474-yne和單胺氧化酶（MAO）抑制劑Pargyline-yne進(jìn)行CATCH成像，結(jié)果清晰展示了藥物-靶點(diǎn)在小鼠不同腦區(qū)的分布（圖2A-E）。另外，還可以展示這些分子主要靶向的細(xì)胞類型，F(xiàn)AAH抑制劑主要靶向新皮質(zhì)和海馬中的神經(jīng)元樣結(jié)構(gòu);而Pargyline-yne主要結(jié)合全腦的血管樣結(jié)構(gòu)，少量下丘腦和腦橋內(nèi)稀疏但特異標(biāo)記的神經(jīng)元樣結(jié)構(gòu)（圖2F）。

圖2 全腦藥物結(jié)合的可視化
 

2.CATCH可與熒光標(biāo)記復(fù)合以識(shí)別靶細(xì)胞類型

作者在給藥處理后進(jìn)行NeuN免疫染色，發(fā)現(xiàn)PF7845-yne和BIA10-2474-yne主要與新皮質(zhì)、海馬和杏仁核中的NeuN+神經(jīng)元共定位。而在腦橋中發(fā)現(xiàn)了一小群神經(jīng)元樣結(jié)構(gòu)，它們是NeuN陰性但被 pargyline-yne 靶向的（圖3A-D）。隨后作者洗脫NeuN并重新孵育TH抗體驗(yàn)證該推測(cè)，確定了NeuN-，Pargyline-yne陽(yáng)性的細(xì)胞的確是LC-NA神經(jīng)元（圖3E）。由此證明，CATCH可以和熒光標(biāo)記結(jié)合揭示了藥物結(jié)合的細(xì)胞類型，并且可以區(qū)分神經(jīng)元不同部分的藥物靶標(biāo)參與位點(diǎn)，可以支持多輪的藥物靶向細(xì)胞類型鑒定。

圖3 藥物靶點(diǎn)的細(xì)胞型鑒定

锘海團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的組織透明化試劑盒可以高效地進(jìn)行脫色脫脂，采用親水性溫和環(huán)境的設(shè)計(jì)，在組織熒光保護(hù)、樣本形態(tài)維持、降低自發(fā)熒光等方面表現(xiàn)出比較優(yōu)異的性能，適用范圍廣、操作簡(jiǎn)便、速度快、效率高。