1. 經(jīng)過(guò)固定的樣品分別在20、40、60、80、100% 甲醇/PBS中逐步脫水1h。
2. 然后將其在33%甲醇/66%二氯甲烷（DCM）的溶液中孵育過(guò)夜。
3. 用100%甲醇洗滌2 × 1 h后，樣品用5% H₂O₂甲醇（1 vol 30% H₂O₂/5 vol甲醇）在4℃漂白過(guò)夜。
4. 漂白后，樣品分別在80、60、40、20%甲醇、PBS中再水化1 h。
5. 為了透明化脊柱，文章中添加了一個(gè)使用莫爾斯溶液的脫鈣步驟，在室溫下孵育30分鐘。使用莫爾斯溶液（1/1檸檬酸鈉和45%甲酸）的弱酸處理可以有效地對(duì)組織脫鈣，同時(shí)保留其結(jié)構(gòu)。
6. 用PBS快速洗滌樣品，然后在PTx2 （PBS/0.2% Triton X-100）中孵育2 × 1 h。在這一步后，對(duì)樣本進(jìn)行免疫染色處理。
7. 樣本在PBS/0.2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M甘氨酸中，37℃孵育24 h。
8. 然后在PBS/0.2% Triton X-100/10% DMSO/6%驢血清中，37℃封閉24 h。
9. 樣品在PTwH （PBS/0.2%吐溫-20與10 mg/ml肝素）/5% DMSO/3%驢血清的一抗稀釋液中，37℃孵育6天。
10. 樣本在PTwH中洗滌5次直至次日。
11. 然后在PTwH/3%驢血清二抗體稀釋中，37℃孵育4天。
12. 最后在PTwH中洗滌5次直至次日。
13. 然后將樣本在33%/DCM 66%甲醇溶液中孵育過(guò)夜。
14. 隨后在100% DCM中孵育2 × 15 min以洗滌甲醇。
15. 最后，樣品在二芐醚（DBE）中孵育，直到透明化（約4 h），即可成像。

參考文獻(xiàn)：

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