如何使siRNA在保持特異性的同時有效降低脫靶效應(yīng)？
小刀最近在準(zhǔn)備講座（名稱：siRNA實驗操作小技巧），這不整理不知道，一整理嚇一跳。那句話怎么說來著？越是看習(xí)慣了的東西，便越是習(xí)焉不察，美丑都難看出。
你別看siRNA的身材小，其中蘊含的奧秘可一點也不少。那么，我們就一起走進(jìn)siRNA，深度探討19bp微觀世界里的那些事兒。
我們知道脫靶效應(yīng)自2003年發(fā)表以來，一直是限制siRNA特異性的關(guān)鍵因素，影響其在功能基因組學(xué)和疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，如何使siRNA在保持特異性的同時減少脫靶效應(yīng)，是各大廠商共同努力的目標(biāo)。Dharmacon siRNA創(chuàng)新性的疊加3種技術(shù)——SMARTselection™技術(shù)、SMARTpool®技術(shù)、ON-TARGETplus™雙鏈修飾技術(shù)，全方面提升siRNA的表現(xiàn)性能，同時保證防脫靶效率>90%。
SMARTselection™特殊設(shè)計算法
1. 種子域頻率分析：調(diào)整反義鏈種子域序列排布，生成低頻種子域siRNA，從而減少miRNA-like脫靶效應(yīng)
圖1 siRNA序列在第1位、第8-19位堿基保持一致，僅改變第2-7位種子域序列
2. SMARTselection™篩選器：針對一個基因設(shè)計多對不同的siRNA，將驗證得到的效果最優(yōu)的4對siRNA投放到產(chǎn)品中，確保siRNA的功能性和特異性
圖2 同一基因的4對siRNA靶向不同作用位點
創(chuàng)新性SMARTpool® 技術(shù)
1. 將4對siRNA等比例mix形成pool，有效降低單對siRNA引起的脫靶效應(yīng)
2. 確保高水平的靶向基因沉默效率：保證每個基因提供的4對siRNA中至少有3對有≥75%的靶基因沉默效率
圖3 SMARTpool能有效減少單對siRNA引起的脫靶效因，同時保持高水平的靶向基因沉默
ON-TARGETplus™雙鏈修飾技術(shù)
1. 全方面減少脫靶效應(yīng)：
1） 正義鏈第1、2堿基處進(jìn)行化學(xué)修飾，有效防止正義鏈進(jìn)入RISC，降低正義鏈引起的脫靶效應(yīng)
2） 反義鏈第2堿基處進(jìn)行化學(xué)修飾，提高反義鏈判別能力，最大程度減少反義鏈脫靶
圖4 脫靶效應(yīng)主要由反義鏈種子域活動引起，單獨修飾正義鏈無法減少脫靶效應(yīng)，雙鏈修飾可最大程度減少脫靶效應(yīng)
2. 保證最優(yōu)的靶向基因沉默效率：有效抑制miRNA-like作用，大幅提高siRNA的靶向敲低作用
圖5 雙鏈修飾抑制正義鏈活動，提高反義鏈判別能力
3. 抑制假陽性顯型出現(xiàn)：有些siRNA會在短期實驗中引起細(xì)胞生長抑制，從而影響靶向基因沉默效率，ON-TARGETplus™修飾能夠有效減少生長抑制，同時保證靶向基因沉默效果
圖6 在乳腺癌細(xì)胞系中研究沉默ARPC1B基因?qū)?xì)胞遷移的影響：均一地刮取單層細(xì)胞，評估細(xì)胞遷移愈合刮口的速度，未修飾的siRNA假陽性顯型明顯，而ON-TARGETplus™修飾能夠有效抑制該現(xiàn)象
綜上，Dharmacon siRNA可提供人、小鼠、大鼠全基因組范圍內(nèi)的預(yù)制siRNA，搭配SMARTselection™、SMARTpool®、ON-TARGETplus™三大技術(shù)，為大家?guī)砀玫膕iRNA用戶體驗。
