利用近紅外三維成像技術(shù)可視化新型反義寡核苷酸納米復(fù)合藥物靶向降壓作用研究

研究背景

研究應(yīng)激性高血壓形成的遺傳和生理機制，探索預(yù)防和治療應(yīng)激性高血壓的新途徑是醫(yī)學(xué)亟待解決的科學(xué)問題之一。所有的抗高血壓藥物都有一些不良副作用，這些副作用有時會成為藥物使用障礙。
反義寡核苷酸與靶RNA的互補位點結(jié)合形成DNA/RNA雙鏈，阻斷RNA功能，使用這些藥物可以最大限度地降低毒副作用。此外，寡核苷酸可以快速定向到任何靶點，而尋找新的小分子藥物可能需要數(shù)年時間。
納米粒子為核酸類藥物進入細(xì)胞提供高效便捷的遞送系統(tǒng)，俄羅斯科學(xué)院西伯利亞分院Asya Levina研究團隊，合成了多種納米復(fù)合藥物（Si-ODN），通過不同給藥途徑的降壓作用進行藥效評價，并對其在體內(nèi)生物分布的動態(tài)變化進行活體三維成像；
相關(guān)研究成果2022年8月發(fā)表在《Journal of Drug Delivery Science and Technology》。


實驗結(jié)果

Si-ODN的合成
研究人員合成了多種納米復(fù)合藥物，Si-ODN1、Si-ODN2和Si-ODN3分別含有靶向結(jié)合AT1A、ADRB1和ACE1的mRNA反義寡核苷酸，隨機序列寡核苷酸的Si-SCR1、Si-SCR2、Si-SCR3作為對照組(表1)。
表1.反義寡核苷酸序列信息

建立應(yīng)激敏感性動脈高血壓大鼠模型（ISIAH），通過不同途徑給藥Si-ODN，如腹腔注射、霧化吸入、靜脈注射、口服和心肌注射，第二天尾套法測定收縮壓。

AT1A mRNA靶向Si-ODN1的降壓作用
隨機序列寡核苷酸的Si-SCR1對照組ISIAH大鼠血壓沒有變化，同時心肌注射和口服給藥后血壓也無明顯變化。靜脈注射Si-ODN1后，血壓在第三天下降30mm Hg，并在第四天開始上升(圖1)。
研究人員利用AT1A受體阻斷劑，氯沙坦(臨床藥物)作為降壓作用的比較數(shù)據(jù)。每天給予氯沙坦(10mg/kg)30天后，ISIAH大鼠血壓從183降至150mm Hg。降壓效果與Si-ODN1相同。然而，大鼠必須每天用氯沙坦治療，而單次注射Si-ODN1藥效能持續(xù)數(shù)天。

圖 1.靜脈注射靶向AT1A mRNA的Si-ODN1納米復(fù)合物后的收縮壓.

ADRB1 mRNA靶向Si-ODN2的降壓作用
腹腔注射靶向ADRB1 mRNA的Si-ODN2，可使血壓在注射后第一天下降約15mm Hg，降壓作用至少持續(xù)5天(圖2a)。靜脈注射Si-ODN2在兩天內(nèi)血壓下降12mm Hg(圖2b)。大鼠心肌內(nèi)注射Si-ODN2后第二天血壓急劇下降(約50mmhg)，兩天后血壓又回到了最初水平。

圖2.腹腔注射和靜脈注射靶向ADRB1 mRNA的Si-ODN2納米復(fù)合藥物后的收縮壓
a：腹腔注射;b:靜脈注射

ACE1 mRNA靶向Si-ODN3的降壓作用
研究人員使用Si-ODN3和Si-mODN3兩種納米復(fù)合藥物進行靜脈注射給藥，Si-mODN3比Si-ODN3更能顯著降低血壓(治療后一天內(nèi)血壓分別下降了20和12mm Hg)(圖 3)。兩種納米復(fù)合藥物作用時間都比較長,并保持了一周的顯著差異。
已知體內(nèi)約80%的ACE1是在肺血管內(nèi)皮中合成的，因此Si-ODN3霧化吸入似乎是有利的。前期實驗證明，吸入后一周血壓逐漸下降，第7天達(dá)到最低值。一直到第15天才回到初始水平。單次吸入時，兩周內(nèi)血壓顯著下降了22mm Hg。
本次實驗中，第一次給藥后的初始血壓水平（200 mm Hg）和最低血壓水平（160 mm Hg）。在第一次吸入后的第5天，血壓升高到180 mm Hg（仍低于初始值200 mm Hg），再次吸入Si-ODN3可使血壓下降至160 mm Hg。血壓值在5天內(nèi)保持在平均175mm Hg，只有在第10天才開始接近初始值（圖4）。因此，影響ACE1基因表達(dá)最有效的方法是周期性地吸入Si~ODN3納米復(fù)合藥物。
使用卡托普利作為藥物對照（舌下）也會降低收縮壓（~30mmHg）。然而，當(dāng)使用反義核苷酸納米復(fù)合藥物時，降壓效果可以持續(xù)數(shù)天，而單次給藥卡托普利的效果僅持續(xù)數(shù)小時。

圖3.靜脈注射靶向ACE1 mRNA的Si-ODN3和Si-mODN3納米復(fù)合藥物后的收縮壓
光柱：Si-ODN3；暗柱：Si-mODN3
圖4.重復(fù)霧化吸入靶向ACE1 mRNA的Si~ODN3納米復(fù)合藥物后的收縮壓

Si-ODN生物毒性的初步研究
通過霧化吸入或腹腔注射給藥后，對動物體重、行為和血細(xì)胞計數(shù)來評價Si-ODN的生物毒性。給藥單劑量(60nmol ODN)和雙倍劑量(120nmol ODN)后第五天，評估在陌生環(huán)境中的活動量，恐懼應(yīng)激（低溫），探索活動(后腿站立，中心區(qū)域停留)等實驗。此外，腹腔注射Si-ODN1后，第五天檢測血細(xì)胞。
結(jié)果表明，單劑量和雙倍劑量的納米復(fù)合藥物對大鼠在曠場實驗和血細(xì)胞含量中無顯著差異。這表明納米復(fù)合材料沒有明顯的毒性，即使劑量增加了兩倍。

表3 腹腔注射Si-SCR1后第5天的體重、血壓和行為特征
表4.腹腔注射Si-SCR1后第5天，ISIAH大鼠的血細(xì)胞計數(shù)

Si-ODN3-Cy7.5體內(nèi)生物分布
熒光標(biāo)記納米復(fù)合藥物
       熒光染料NHS-Cy7.5(750nmol)與含反義寡核苷酸ODN3-NH2(100nmol)在水-二甲基亞砜混合物(1:1,100μl)中，在0.1 M Tris-HCl、pH8.3、4℃反應(yīng)16h，標(biāo)記寡核苷酸。
       ODN3-Cy7.5用2% LiClO4丙酮中沉淀，然后用丙酮洗滌兩次，溶于50μlH2O中。通過吸光度計算濃度，ODN3-Cy7.5（Amax =788nm)的濃度0.4mM。納米粒子、寡核苷酸和Cy7.5的終濃度分別為240mM、1.6mM和0.8mM。
動物模型
       用8-9周齡SPF雄性SCID小鼠，作為納米復(fù)合藥物體內(nèi)分布的動物模型。一組靜脈注射0.1nmol的Si-ODN3-Cy7.5；另一組霧化吸入0.1nmol的Si-ODN3-Cy7.5，霧化30分鐘；兩組在給藥后0.4、1、3、7和14天進行掃描。為了校正熒光信號，分別將1nmol和0.1nmol的Si-ODN3-Cy7.5溶液分別注射小鼠的兩側(cè)股骨肌內(nèi)，注射后立即進行掃描。三維活體斷層成像 ( FLECT )
       使用InSyTe FLECT/CTTM (TriFoil Imaging，Chatsworth，CA，USA) 熒光/x-射線計算機斷層掃描成像。
       CT參數(shù):管電壓30kV，管電流950μA，曝光時間180ms；采用360°連續(xù)旋轉(zhuǎn)掃描技術(shù)，360幀投影；圖像分辨率為25×25×25μm，總掃描時間為8分鐘。
       FLECT參數(shù)：使用730nm激發(fā)光，853nm濾光片，曝光時間為16ms；360°連續(xù)旋轉(zhuǎn)掃描技術(shù)，116幀投影；圖像分辨率為1×1×1mm，總掃描時間為60分鐘。使用TriFoil Imaging軟件(chat-worth，USA)重建圖像。在VivoQuantv3.0軟件(Invicro，USA)中將重建的3D CT和FLECT圖像配準(zhǔn)融合，使用VivoQuantv3.0定量。

Si-ODN3-Cy7.5 FLECT/CT成像
       靜脈注射Si-ODN3-Cy7.5，主要在肝臟和腎臟中積累(圖5a和b)。在注射后第一天，熒光累積達(dá)到最大值，兩周內(nèi)逐漸從體內(nèi)代謝清除(圖5d)。
       霧化吸入Si-ODN3-Cy7.5，熒光主要在胃腸粘膜積聚，原因是吸入了沉積在鼻咽部的物質(zhì)。在大腦(下丘腦，垂體)中檢測到標(biāo)記熒光(圖 5c)，吸入后第一天，熒光積累達(dá)到最大，隨后逐漸從體內(nèi)清除。(圖5e)
       在靜脈給藥的情況下，ACE1靶向納米復(fù)合藥物在腎臟中的積累，可以作為降低高血壓ISIAH大鼠血壓的決定性因素，因為腎臟是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的核心器官。吸入納米復(fù)合藥物時血壓下降的原因，也可能是因為在具有腎素-血管緊張素系統(tǒng)的大腦中積累。

圖5 小鼠體內(nèi)檢測標(biāo)記熒光結(jié)果。
靶向ACE1 mRNA的Si-ODN3-Cy7.5經(jīng)眼眶靜脈竇注射(a，b)和吸入(c);腎臟、肝臟(d)和腦(e)中標(biāo)記熒光的動態(tài)變化。
1.眼眶靜脈竇; 2.腎; 3.肝;4.腸;5.鼻咽;6.下丘腦和垂體。

研究結(jié)論
研究團隊提出了一個最佳治療ISIAH方案，定期霧化吸入靶向 ACE1 mRNA 的寡核苷酸納米復(fù)合藥物，同時這種方法恰好也是臨床上可能使用的優(yōu)選方法。

小編寄語
       FLECT/CT作為當(dāng)前真正實現(xiàn)光學(xué)360°掃描的活體成像技術(shù)，暫時處于全球小動物三維成像檢測設(shè)備和定量分析的領(lǐng)導(dǎo)地位，擁有卓越的檢測靈敏度，能夠提供更高質(zhì)量、更豐富的實驗數(shù)據(jù)。
       重要的是，通過三維熒光斷層掃描，能夠無創(chuàng)檢測對同一小鼠在不同時間點（0.4、1、3、7和14天），納米復(fù)合藥物在腎臟、肝臟和腦中的藥物積累（Si-ODN3-Cy7.5×10^-9，mol），進行絕對定量的動態(tài)分析，保證了實驗的連續(xù)性，助力納米復(fù)合藥物的靶向作用和代謝清除動態(tài)變化等研究。

期刊名稱：Journal of Drug Delivery Science and Technology
原文標(biāo)題：In vivo hypotensive effect of aminosilanol-based nanocomposites bearing antisense oligonucleotides
作者：Asya Levina *，Marina Repkova ,et,al.
發(fā)表單位：Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine,Siberian Branch of RAS
發(fā)表時間：2022年8月
DOI：https://doi.org/10.1016/j.jddst.2022.103612

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