一、前言
CAR-T 細(xì)胞療法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell immunotherapy）即：嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法，是指通過向T細(xì)胞中導(dǎo)入一種人工設(shè)計(jì)的CAR分子，賦予T細(xì)胞靶向功能，再將這種改造后的CAR-T細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)進(jìn)行治療。CAR-T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞機(jī)制不具有MHC限制性，通過結(jié)合靶向抗原即可被活化，從而高效殺傷腫瘤細(xì)胞。CAR是一種的人工改造的受體分子，它可以賦予免疫細(xì)胞被某個(gè)特定靶點(diǎn)激活的特異性，從而增強(qiáng)細(xì)胞識(shí)別抗原信號(hào)與活化的功能。

因此，CAR分子的設(shè)計(jì)是CAR-T細(xì)胞療法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。盡管CAR-T細(xì)胞療法在血液瘤中取得了空前成功，但依舊面臨一些挑戰(zhàn)，例如在CAR分子設(shè)計(jì)和細(xì)胞功能的改進(jìn)等方面仍有很大的空間。

二、CAR分子的基本結(jié)構(gòu)
CAR分子包括三個(gè)主要部分：胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域（圖1）。胞外域中的抗原結(jié)合域通常是一個(gè)抗體來源的單鏈片段scFv分子，主要由抗體的可變輕鏈（V_L）和可變重鏈（V_H）及中間的Linker區(qū)連接組成，再通過鉸鏈區(qū)（Hinge）連接到跨膜結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)識(shí)別抗原。跨膜域的主要功能在于將CAR分子錨定在細(xì)胞膜上，其對(duì)CAR分子表達(dá)的穩(wěn)定性具有重要作用。胞內(nèi)域則包括共刺激結(jié)構(gòu)域和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，二者合力負(fù)責(zé)T細(xì)胞的完全活化。
 

圖1 CAR分子結(jié)構(gòu)示意圖
 

以下將對(duì)CAR分子的各個(gè)部分逐一介紹。

1.胞外域
抗原結(jié)合域——scFv
scFv靶向腫瘤抗原的特異性及親和力是CAR-T療法安全有效性的基礎(chǔ)。腫瘤相關(guān)抗原（TAA）是免疫治療的主要靶點(diǎn)，在腫瘤組織中高度表達(dá)，在健康組織中也有較低水平表達(dá)。這會(huì)形成對(duì)非腫瘤組織的脫靶損傷（On-target, Off-tumor），有時(shí)還會(huì)產(chǎn)生危及生命的毒性。因此，用于CAR分子設(shè)計(jì)的scFv的特異性至關(guān)重要。為了避免On-target, off-tumor副作用，抗體的特異性研究是十分重要的。

scFv的親和力特征是一個(gè)特別重要的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域參數(shù)，它解釋了多種受體－配體相互作用，從根本上決定了CAR分子的功能。為了識(shí)別腫瘤細(xì)胞上的抗原，誘導(dǎo)CAR信號(hào)傳導(dǎo)并激活T細(xì)胞，CAR分子的抗原結(jié)合親和力必須適中，一方面親和力要足夠誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，另一方面親和力又不能高到對(duì)有抗原低表達(dá)的組織產(chǎn)生毒性以及過度激活導(dǎo)致的自身耗竭和死亡。此外，為了優(yōu)化CAR分子與其靶抗原的結(jié)合，必須考慮其他因素，例如表位位置、靶細(xì)胞上的配體密度以及單個(gè)配體結(jié)合域的親和力等。

除了簡(jiǎn)單地識(shí)別和結(jié)合目標(biāo)表位外，scFv的其他特征也會(huì)影響CAR功能。例如，V_H和V_L兩條鏈之間的相互作用方式以及互補(bǔ)決定區(qū)的相對(duì)位置都會(huì)影響CAR分子對(duì)其目標(biāo)表位的親和力和特異性。而目標(biāo)表位的結(jié)構(gòu)、空間可用性和功能方面也需要考慮在CAR分子的設(shè)計(jì)中。

最后，免疫原性也是必須考慮的因素。利用雜交瘤技術(shù)制備的鼠源單克隆抗體（mAb）具有較強(qiáng)的免疫原性，可被人體免疫系統(tǒng)視為抗原，觸發(fā)免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，甚至引發(fā)嚴(yán)重的免疫疾病。因此，scFv的人源化有助于提高CAR-T細(xì)胞的安全性和治療潛力。

總結(jié)來說，scFv的親和力、特異性、目標(biāo)表位和免疫原性這四個(gè)特征對(duì)于CAR-T分子的設(shè)計(jì)至關(guān)重要。

鉸鏈區(qū)——Hinge
鉸鏈或間隔區(qū)由CAR分子的非抗原結(jié)合細(xì)胞外區(qū)域組成。鉸鏈區(qū)的功能是提供克服空間障礙的靈活性，允許抗原結(jié)合域進(jìn)入目標(biāo)表位。鉸鏈區(qū)的長(zhǎng)度和組成的差異會(huì)影響CAR分子的表達(dá)、柔韌性，以及信號(hào)傳導(dǎo)、表位識(shí)別等，最終影響CAR分子的功能。因此，必須針對(duì)每個(gè)特定的抗原結(jié)合域進(jìn)行量身定制，從而確定最佳的鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)。

2.跨膜域
跨膜結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)將CAR分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域連接起來，從而將配體識(shí)別信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)。由于跨膜域經(jīng)常根據(jù)細(xì)胞外間隔區(qū)或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域的要求而變化，因此在設(shè)計(jì)CAR分子時(shí)必須考慮到這些因素。

3.胞內(nèi)域
共刺激結(jié)構(gòu)域
CAR分子中的共刺激結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)給T細(xì)胞提供第二個(gè)激活信號(hào)。最常見的共刺激域是CD28和4-1BB，CD28共刺激因子可誘導(dǎo)更強(qiáng)烈的急性反應(yīng)，但其作用持久性有限；而4-1BB因子的激活能力較低，卻具有較高的長(zhǎng)期持久性。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域
T細(xì)胞受體（TCR）在細(xì)胞內(nèi)與CD3二聚體密切相關(guān)，后者攜帶基于免疫受體酪氨酸的激活基序（ITAM），ITAM在被淋巴細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)酪氨酸激酶（LCK）磷酸化后啟動(dòng)T細(xì)胞激活信號(hào)。多年來，CD3ζ鏈已被用作標(biāo)準(zhǔn)的CAR分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，而ITAM的數(shù)量及位置等因素也可為CAR分子的設(shè)計(jì)提供信息。

三、迭代進(jìn)化中的CAR分子
根據(jù)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)的不同以及引入細(xì)胞因子和配體的差異，CAR分子目前可分為五個(gè)不同的代次（圖2）：
 

圖2 CAR分子的迭代^[1,2]

1.第一代CAR
上世紀(jì)八十年代末，Zelig Eshhar團(tuán)隊(duì)^[3]大膽地將抗體scFv與CD3ζ直接融合成一個(gè)蛋白質(zhì)，且證明表達(dá)這樣融合蛋白的T細(xì)胞能傳導(dǎo)信號(hào)、分泌白細(xì)胞介素并在體外殺死表達(dá)特定抗原的淋巴瘤細(xì)胞，至此第一代CAR-T產(chǎn)生。由于沒有共刺激域，第一代CAR-T的信號(hào)傳導(dǎo)效率低下，并且體內(nèi)增殖能力較弱、存活時(shí)間都較短，最終未能在臨床應(yīng)用中獲得預(yù)期的療效。

2.第二代CAR
科學(xué)家在第一代CAR-T的基礎(chǔ)上引入了一個(gè)共刺激域（CD28或4-1BB），增強(qiáng)了T細(xì)胞對(duì)活化信號(hào)的響應(yīng)能力，并且在臨床治療中展現(xiàn)了令人驚喜的治療效果。目前上市的CAR-T藥物均為二代產(chǎn)品，如Kymriah和Yescarta等。

3.第三代CAR
第三代CAR-T在第二代的基礎(chǔ)上引入了兩個(gè)共刺激域（CD28和4-1BB），以期望達(dá)到更好的信號(hào)傳導(dǎo)的效果。然而共刺激信號(hào)不是簡(jiǎn)單的相加，增加多個(gè)共刺激因子也可能因?yàn)楦淖僀AR-T胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度而導(dǎo)致原有的信號(hào)減弱或不能傳遞。因此這種方法提供的臨床益處仍存在爭(zhēng)議。

4.第四代CAR
為了增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的功能，第四代CAR-T引入了一個(gè)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域共表達(dá)一些小分子物質(zhì)（如促炎癥細(xì)胞因子IL-12），能夠觸發(fā)由細(xì)胞因子誘導(dǎo)的信號(hào)或者阻斷影響CAR-T細(xì)胞功能的一些信號(hào)通路，以期收獲更強(qiáng)的療效。

5.第五代CAR
第五代CAR-T即通用型CAR-T，是指從健康志愿者獲取T細(xì)胞并進(jìn)行基因編輯敲除相關(guān)基因，然后轉(zhuǎn)入CAR基因制成的CAR-T細(xì)胞，最主要的優(yōu)勢(shì)在于不需要從患者體內(nèi)獲取T細(xì)胞進(jìn)行定制，而是可以做到現(xiàn)貨供應(yīng)，從而節(jié)約時(shí)間和治療花費(fèi)。

四、總結(jié)
CAR分子結(jié)構(gòu)的每個(gè)模塊都獨(dú)立并協(xié)同地影響CAR-T細(xì)胞的功能。一般來說，嘗試在scFv和共刺激分子方面進(jìn)行改造是CAR分子設(shè)計(jì)和優(yōu)化的切入點(diǎn)。除了以上提到的五代CAR以外，還有其他基于不同目的的新穎CAR分子也被設(shè)計(jì)出來，例如針對(duì)抗原丟失的雙價(jià)串聯(lián)CAR、特異性識(shí)別健康組織的抑制性CAR、攜帶自殺基因以提高安全性的CAR等等。然而，也有研究證明鉸鏈區(qū)和跨膜域可能是CAR分子設(shè)計(jì)的重要潛在組成部分，對(duì)于改善基于CAR的抗腫瘤功能至關(guān)重要。由于CAR分子的設(shè)計(jì)環(huán)節(jié)涉及到多個(gè)組分，使得CAR優(yōu)化過程難以測(cè)試，因此必須進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)估和考量，為合理設(shè)計(jì)下一代CAR-T細(xì)胞指明方向。

參考文獻(xiàn)：
[1] Mchayleh, W.; Bedi, P.; Sehgal, R.; Solh, M. Chimeric Antigen Receptor T-Cells: The Future Is Now. J. Clin. Med. 2019, 8, 207.

[2] Hughes-Parry Hannah E., Cross Ryan S., Jenkins Misty R.(2019). The Evolving Protein Engineering in the Design of Chimeric Antigen Receptor T Cells. Int J Mol Sci, 21(1), undefined. doi:10.3390/ijms21010204

[3] Eshhar, Z., Waks, T., Gross, G. and Schindler, D. G., Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors. Proc Natl Acad Sci USA 1993. 90: 720–724.