STORM的數(shù)字圖像處理系統(tǒng)
“數(shù)字圖像處理是通過圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)功能處理和分析的技術(shù)。在storm(stochastic optical reconstruction microscopy)系統(tǒng)中,生物樣本信息經(jīng)由光路放大后,投射到系統(tǒng)的主相機(jī)感光板上,轉(zhuǎn)化為數(shù)字圖像數(shù)據(jù),由數(shù)字圖像處理系統(tǒng)統(tǒng)一進(jìn)行處理。本文就storm的數(shù)字圖像處理系統(tǒng)給大家做個(gè)介紹。”
01成像原理
由于光學(xué)衍射極限的存在,對于200納米以下的顯微樣品結(jié)構(gòu),就無法利用光學(xué)放大的方式去進(jìn)行觀測,舉個(gè)例子,圖1(a)和圖1(b)是兩個(gè)在數(shù)字圖像中坐標(biāo)位置不同的光斑,將兩個(gè)光斑進(jìn)行疊加,獲得圖1(c)的重合光斑。由此可知,圖1(c)是由圖1(a)和圖1(b)兩個(gè)結(jié)構(gòu)結(jié)合而成的,但由于衍射極限的存在,我們無法將圖1(c)進(jìn)行放大,從而獲得前者的兩個(gè)結(jié)構(gòu)特征,這就是storm系統(tǒng)中數(shù)字圖像處理系統(tǒng)要解決的實(shí)際問題:如何通過有效的圖像數(shù)據(jù),獲得200納米衍射極限下的樣本結(jié)構(gòu)信息。
圖1光斑疊加
“無論一個(gè)樣品結(jié)構(gòu)有多復(fù)雜,總是能夠描述為是由一個(gè)個(gè)點(diǎn)構(gòu)成的。”這就是storm的核心原理,如圖2所示,假設(shè)圖1中的兩個(gè)光斑結(jié)構(gòu)在不同時(shí)間分別進(jìn)行閃爍,對閃爍的每一幀圖像數(shù)據(jù)中的高斯光斑進(jìn)行捕捉和擬合,獲得高斯光斑的中心位置并記錄,在完成拍攝后,將所有記錄下的光斑信息進(jìn)行疊加重構(gòu),便可獲得完整的結(jié)構(gòu)信息。
圖2隨機(jī)光斑疊加
在storm系統(tǒng)中,通過生物試劑以及光學(xué)激發(fā),利用計(jì)算機(jī)處理相機(jī)拍攝到的隨機(jī)熒光閃爍,并對閃爍的光斑進(jìn)行統(tǒng)一分析,就可獲得生物樣本200納米以下的結(jié)構(gòu)信息,如圖3為數(shù)字圖像處理系統(tǒng)處理后得到的細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖。
圖3storm拍攝細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)
02誤差矯正
1、串色
串?dāng)_問題可以定義為熒光從一個(gè)通道到其他通道的泄漏,串?dāng)_的原因是因?yàn)槎喾N熒光染料的發(fā)射光譜重疊。然而,二向色鏡無法完全阻擋重疊光譜,這就導(dǎo)致當(dāng)前通道上會(huì)出現(xiàn)不屬于該通道的圖像信息。
圖4圖像中存在的串色
要解決串?dāng)_問題,首先要確定串?dāng)_的比例,拍攝單一染料的寬視場圖像,然后得到每個(gè)樣品中每個(gè)通道的平均強(qiáng)度,以形成包含所有九個(gè)平均強(qiáng)度的強(qiáng)度矩陣,通過圖像系統(tǒng)中的串色抑制算法,便可在原始圖像數(shù)據(jù)上做抑制,通過圖像數(shù)據(jù)計(jì)算的方式解決串色問題。
2、通道對齊
storm系統(tǒng)支持多通道同時(shí)成像,在硬件結(jié)構(gòu)上,光路結(jié)構(gòu)的差異和色差造成各個(gè)通道之間存在一定的誤差。
如圖6所示,紅通道(561nm激光)與綠通道(647nm激光)在拍攝金納米粒子時(shí)產(chǎn)生的圖像分離。
圖5通道的偏移
經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),由于光路傳遞的原因,會(huì)造成每個(gè)通道會(huì)產(chǎn)生不同的程度的畸變與距離偏差,為了抵消這些系統(tǒng)誤差,數(shù)字圖像系統(tǒng)利用金納米粒子對系統(tǒng)誤差進(jìn)行修正,在拍攝好金納米粒子的寬場圖像后,對每個(gè)熒光點(diǎn)在x與y方向進(jìn)行通道誤差計(jì)算,獲得每個(gè)金納米點(diǎn)與對應(yīng)通道上的最近鄰匹配點(diǎn)的誤差數(shù)據(jù),通過對齊算法,最終確定當(dāng)前通道與對應(yīng)通道之間的誤差關(guān)系。
3、3D校準(zhǔn)
storm不僅可以拍攝生物樣本的二維信息,還可以對生物樣本的三維信息進(jìn)行分析與重構(gòu),這時(shí)就需要對三維方向上的誤差進(jìn)行校準(zhǔn),以便展示給用戶的是最準(zhǔn)確的信息。
三維信息獲取的一種方式是依靠系統(tǒng)光路中的柱面鏡對成像造成的影響,如圖6所示在加入柱面鏡后,當(dāng)發(fā)光點(diǎn)位于焦平面下方時(shí),捕獲到的光斑為豎直方向拉伸,同理,當(dāng)發(fā)光點(diǎn)位于焦平面上方時(shí),捕獲到的光斑為橫方向拉伸。利用這個(gè)特性,通過對光斑形態(tài)的分析,便可獲得每個(gè)光斑在超高亞像素上的長寬邊界差值與深度信息的曲線關(guān)系,從而反向推導(dǎo)出該發(fā)光點(diǎn)的實(shí)際深度信息。
圖6柱面鏡對光斑的影響
在獲得每個(gè)閃爍光斑的深度信息后,storm便可對拍攝樣本進(jìn)行3D重構(gòu),獲得如下效果:
圖7重構(gòu)后的肌動(dòng)蛋白長絲的 x-y 和 x-z 橫截面
03 總結(jié)
超分辨率顯微作為一類很新的技術(shù),突破了光學(xué)成像中的衍射極限,把傳統(tǒng)成像分辨率提高了10~20倍,成為研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)的利器。過去七八年間,這些技術(shù)不斷推進(jìn),先后實(shí)現(xiàn)了多色、三維和活細(xì)胞高速成像,這些技術(shù)的發(fā)展都離不開數(shù)字圖像處理技術(shù)的功勞?萍嫉倪M(jìn)步,有賴于站在巨人的肩膀上,將各個(gè)不同領(lǐng)域的技術(shù)和智慧有機(jī)結(jié)合,這便是storm的魅力所在。
參考文獻(xiàn)
[1] 張世超, 李思黽, 楊光,等. 3D-STORM超分辨成像中單分子軸向定位精度優(yōu)化研究[J]. 光子學(xué)報(bào), 2015(10):6.
[2] Rust M J . Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).[J]. Nature Methods, 2010, 3.
[3] Yu, Lujia. Three color super-resolution localization microscopy for optical mapping of stretched DNAs in nanochannels.Thesis (M.Phil.)--Hong Kong University of Science and Technology, 2019