上一期，我們大致介紹了化學發(fā)光免疫分析的原理和優(yōu)缺點，下面我們就來詳細說說三種分類的不同之處。
 

01  直接化學發(fā)光免疫分析

直接化學發(fā)光免疫分析（CLIA）是用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標記的化學發(fā)光物質有吖啶酯類化合物——acridinium ester (A E) , 是有效的發(fā)光標記物。其通過起動發(fā)光試劑（NaOH₂、H₂O₂）作用而發(fā)光，強烈的直接發(fā)光在一秒鐘內完成， 為快速的閃爍發(fā)光。
 
吖啶酯作為標記物用于免疫分析，其化學反應簡單、快速、無須催化劑；檢測小分子抗原采用競爭法，大分子抗原則采用夾心法，非特異性結合少，本底低；與大分子的結合不會減小所產(chǎn)生的光量， 從而增加靈敏度。
 
CLIA開發(fā)主要包括以下幾個步驟：
 

磁珠包被抗體

( 以下步驟需依據(jù)項目不同進行工藝優(yōu)化 )

BeaverBeads®Streptavidin鏈酶親和素磁珠

利用鏈酶親和素和生物素的高特異性結合能力，BeaverBeadsRStreptavidin可與biotin標記的高純度抗體/多肽分子或核酸分子特異性結合，并具有級聯(lián)放大的作用，是一種通用的具有標記和捕獲性能的固相介質原料。

 

根據(jù)粒徑的不同，產(chǎn)品可用免疫檢測、探針捕獲、細胞分選等領域，尤其適用于化學發(fā)光免疫診斷。

 
BeaverBeads®NHS生物配體快速偶聯(lián)磁珠

表面為NHS基團修飾的磁珠，能夠與帶有伯胺基團的蛋白和其他分子形成穩(wěn)定的肽鍵，用于親和純化或者分析檢測抗體、抗原和其他生物分子。

 

與傳統(tǒng)的羧基、氨基磁珠相比，無需事先采用EDC/NHS或戊二醛進行活化，只需簡單講含伯氨基的生物配體溶解于偶聯(lián)緩沖液中，室溫下將蛋白溶液與NHS磁珠混合即可將生物配體共價偶聯(lián)到磁珠上，偶聯(lián)效率可達90%以上；偶聯(lián)體系pH為5-9.

 
BeaverBeads®Polymer聚合物磁珠

具有快速磁響應性超順磁性、良好的分散性、粒徑均一、極低的非特異性吸附和豐富的結合位點等特點。在特定試劑（如EDC/NHS）作用下，將多種生物配體（蛋白、多肽、寡聚核苷酸、藥物分子等）共價偶聯(lián)到磁珠表面。常用于檢測、捕獲等試驗。

 
Beaver Magnetic Seprator stand磁性分離器

為快速分離磁珠的手工操作或高通量的自動化操作而設計的一系列不同規(guī)格的專用磁性分離工具，適用于抗體純化、免疫沉淀、免疫共沉淀、細胞分選、核酸分離等相關實驗。

 

吖啶酯標記抗體

①將0.5mg抗體用標記緩沖液（0.1M pH7.4 PB）預處理；
②將0.1mg的吖啶鹽加入到預處理的抗體中，放置于恒溫搖床中避光孵育過夜；
③標記完成后，將結合物純化，加入BSA等蛋白保護劑，4℃避光保存。
 
吖啶酯是一類可用作化學發(fā)光標記物的化學物質，吖啶酯或吖啶磺酰胺類化合物在有H₂O₂的稀堿性溶液中即能發(fā)光，不需要催化劑，發(fā)光系統(tǒng)簡單。
 
同時這類化合物的發(fā)光為閃光型，加入發(fā)光啟動試劑后0.4s左右發(fā)射光強度即達到最大，半衰期為0.9s左右，非常省時。
 
基于上述特點，為增強吖啶酯或吖啶磺酰胺類化合物的化學發(fā)光強度，有些在發(fā)光啟動試劑中加入triton x-100、tween-20等表面活性劑。
 

上機檢測實驗

①將磁珠包被物和吖啶酯標記物分別稀釋至工作濃度，配成試劑；
②設置全自動化學發(fā)光儀，裝載試劑，標準品質控品樣本分別上機，選擇對應的項目，直接進行檢測；
③檢測剩余時間及檢測結果會顯示在屏幕上，可通過“查詢”查看歷史數(shù)據(jù)，點擊“導出”可將數(shù)據(jù)保存為Excel格式文件。
 

02   間接化學發(fā)光免疫分析

間接化學發(fā)光免疫分析又稱化學發(fā)光酶免疫分析，以酶標記生物活性物質進行免疫反應，免疫復合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測試。常用的標記為HRP和AP，它們的底物分別為魯米諾和AMPPD。
 
1 具體工藝流程：
 
 

包被抗體的磁性微粒

 

加入樣本、標準品

 

清洗

 

加入酶標抗體/生物素化抗體

 

洗板

 

加入鏈酶親和素HRP

 

清洗

 

加入底物液

 

測試發(fā)光信號（如是板式發(fā)光可參考Elisa操作方式）

 

03   電化學發(fā)光免疫分析

電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA）是電化學發(fā)光和免疫測定相結合的產(chǎn)物，是目前最先進的標記免疫測定技術之一。
 
在電極表面有電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應，用電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕 [Ru(bpy) 3 ] 2+ 標記 Ab，通過 Ag-Ab 反應和磁珠分離技術，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的 Ag或 Ab 進行定量 / 定性。
 
ELIA 具有高度敏感，可達 Pg/ml 或 pmol ；特異性強，可重復性好，CV<5%；測定范圍寬；試劑穩(wěn)定，無毒害，無污染，有效期長。操作簡單，易于自動化。