許多表達(dá)Cre的品系在構(gòu)建小鼠模型時(shí)均有著不明顯或未表征的表型。
 
而其中的一些表型（包括意外表達(dá)模式和不可預(yù)測(cè)的刪除效率）可能會(huì)讓實(shí)驗(yàn)人員很難對(duì)實(shí)驗(yàn)作出解釋，由此導(dǎo)致Cre-lox神話破滅。
 
那么，要如何解決這些問(wèn)題呢？
   
 
脫靶Cre表達(dá)

當(dāng)Cre不在驅(qū)動(dòng)Cre表達(dá)的啟動(dòng)子直接支配下表達(dá)在其他組織或器官中時(shí)，就會(huì)發(fā)生脫靶Cre表達(dá)。 
 
如果Cre品系發(fā)生這種情況，而實(shí)驗(yàn)人員又無(wú)法發(fā)現(xiàn)，那么floxed小鼠基因可能會(huì)在意想不到的組織中被刪除。 
 
因此：需要充分了解cre品系的表達(dá)模式
   
 
生殖系中的脫靶Cre表達(dá)
 
生殖系中的脫靶Cre表達(dá)可能會(huì)特別棘手，因?yàn)槟�的鼠群中可能�?huì)出現(xiàn)所有細(xì)胞中都有完全重組的敲除等位基因的小鼠。
 
通常，生殖系表達(dá)Cre是因?yàn)闇p數(shù)分裂后卵母細(xì)胞中持續(xù)存在Cre RNA或蛋白質(zhì)。
 
對(duì)于許多Cre品系（不是全部）
   
 
LoxP位點(diǎn)重組效率低下

Cre重組loxP位點(diǎn)的效率受loxP位點(diǎn)在基因組內(nèi)的位置以及它們之間距離的影響。因此，相同Cre轉(zhuǎn)基因切割不同loxP等位基因的效率可能不同。
 
如果您發(fā)現(xiàn)loxP基因沒(méi)有被有效切割（也就是您的floxed 鼠靶標(biāo)的基因表達(dá)水平?jīng)]有被充分降低），這可能會(huì)非常令人沮喪，那該怎么做呢？
 
1  步驟一
如果您發(fā)現(xiàn)自己遇到了這種情況，應(yīng)重新對(duì)小鼠進(jìn)行基因分型（使用新DNA樣本），確認(rèn)您的小鼠是loxP等位基因純合子并攜帶Cre轉(zhuǎn)基因。 
 
2  步驟二
接下來(lái)，檢查您測(cè)試刪除效率/基因表達(dá)所用的方法，確保其適用于您的特異性loxP等位基因。
 
比如，如果條件性等位基因使loxP位點(diǎn)位于目標(biāo)基因外顯子5的位置，則在重組后，外顯子5會(huì)被刪除，但外顯子1-4和啟動(dòng)子會(huì)保持完整，并且仍可產(chǎn)生重組基因座的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
 
如果監(jiān)測(cè)mRNA表達(dá)的引物落在外顯子5的上游區(qū)域，您可能看不到表達(dá)水平顯著下降。 
 
3  步驟三
如果您確認(rèn)Cre未有效切割您的loxP基因，應(yīng)嘗試將目標(biāo)基因的完整敲除等位基因引入鼠群，獲得攜帶目標(biāo)基因復(fù)合雜合子（一個(gè)loxP側(cè)翼等位基因和一個(gè)敲除等位基因）及Cre轉(zhuǎn)基因的小鼠。
 
在這些小鼠中，Cre只需重組一個(gè)loxP等位基因即可，而不是兩個(gè)，這樣可以提高其重組效率。
 
 
他莫昔芬誘導(dǎo)的Cre品系

如果您的Cre品系是他莫昔芬誘導(dǎo)的Cre品系，則按照上述步驟1和2操作。
 
接下來(lái)，將他莫昔芬誘導(dǎo)的Cre品系與Cre報(bào)告基因品系進(jìn)行雜交。  在Cre陽(yáng)性、報(bào)告基因陽(yáng)性小鼠中測(cè)試您的他莫昔芬給藥方案，確認(rèn)他莫昔芬能否到達(dá)目標(biāo)組織/器官并有效誘導(dǎo)重組。
 
事實(shí)上，最好在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)就這樣做，以便提前制定他莫昔芬誘導(dǎo)方案。
   
如果清楚了解所有這些步驟，則如上所述（步驟3）引入完整敲除等位基因或許可以提高他莫昔芬依賴性重組效率。
 
 
自發(fā)性Cre表型

Cre可能會(huì)自行產(chǎn)生表型，這會(huì)使數(shù)據(jù)解釋變得更加困難。
 
造成這種情況的原因可能是Cre轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)對(duì)附近內(nèi)源基因有影響。
 
另外，由于小鼠基因組中的隱性半同源loxP位點(diǎn)之間重組會(huì)造成“Cre 毒性”，因此，Cre高表達(dá)的小鼠可能會(huì)出現(xiàn)突變表型或死亡。  
 
為了確保您觀察到的所有表型是由于目標(biāo)基因被刪除而不是Cre轉(zhuǎn)基因引起的，您需要在實(shí)驗(yàn)中納入攜帶相應(yīng)loxP等位基因的野生型Cre陽(yáng)性小鼠作為對(duì)照小鼠。
 
在創(chuàng)建下一個(gè)條件性敲除模型之前，您應(yīng)該熟悉要使用的品系中Cre的表達(dá)模式。

杰克森實(shí)驗(yàn)室Cre資源