多維度的 CRISPR-Cas9 基因篩選

圖 1. 多維分析顯示線粒體自噬需要 ANT
 

ANT 促進(jìn)細(xì)胞吞噬不依賴于ADP / ATP交換活性

ANT 位于線粒體內(nèi)膜上，介導(dǎo) ADP 和 ATP 的跨膜交換，向線粒體 ATPase 提供 ADP 。藥理性抑制 ADP / ATP 的交換作用加劇了線粒體自噬。然而，盡管 Ant1 或Ant2 基因的缺失加劇 CCCP 誘導(dǎo)的膜極化，卻反常地抑制了線粒體自噬，因此，ANT 是通過其他機(jī)制抑制了線粒體自噬。ADP/ATP 交換相關(guān)突變 Ant1 (K43E/R244E) 能有效挽救線粒體自噬，保留 ADP/ATP 交換的疾病突變體 Ant1 (A90D),ANT1 (A123D) 不起作用。因此，ANT 促進(jìn)線粒體自噬不依賴于ADP/ATP 交換活性。

ANT 的缺失抑制 PINK1 依賴的氧化應(yīng)激以及氧化磷酸化毒性引起的線粒體自噬，表明 ANT 在 PINK1 的上游起作用。正常情況下，PINK1 會(huì)被胞質(zhì)蛋白酶體組成型降解。但當(dāng)線粒體受損后，TIM23 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)被抑制，使 PINK1 逃逸降解，并將 Parkin 募集到線粒體。ANT1 或者 ANT2 缺失時(shí)，CCCP 不能誘導(dǎo) PINK1 保持穩(wěn)態(tài)，而野生型、K43E/R244E 突變型的 ANT1 維持 PINK 的穩(wěn)態(tài)。相比之下，CCCP 觸發(fā)的 TIM23 介導(dǎo)的蛋白易位到基質(zhì)中的抑制和 Su9-DHFR 前體的裂解減弱，表明 ANT1 或 ANT2 是抑制 TIM23 所必需。此外，ANT1 和 ANT2，ANT1(K43E/R244E) 都能與 TIM23 的相互作用，且 ANT1 (K43E/R244E) 還能抑制 TIM23，但 ANT1(A90D) 和 ANT1(A123D) 均不能。綜上，ANT 通過與 TIM23 相互作用，抑制 TIM23 轉(zhuǎn)錄酶響應(yīng)生物能崩潰，與 TIM23 作為 ADP/ATP 交換載體的活性無(wú)關(guān)。

ANT 通過 TIM44 介導(dǎo) TIM23 的抑制

TIM44 是 TIM23 復(fù)合物的基質(zhì)側(cè)組分，其控制多肽跨 TIM23 的轉(zhuǎn)運(yùn)。TIM44 敲除結(jié)果表明 TIM44 可能介導(dǎo) TIM23-ANT1 的相互作用。TIM44 的丟失使線粒體吞噬和 PINK1 積累都變鈍。ANT1 (G146E/K147D) 不能在缺少 ANT1 的細(xì)胞中挽救線粒體自噬，但致病突變體 ANT1（A90D）也破壞了與 TIM44 的相互作用。相反， TIM44 (K282D) 盡管保留了與 TIM23 自身結(jié)合的能力，但無(wú)法挽救缺少 TIM44 的細(xì)胞的線粒體自噬。綜上數(shù)據(jù)表明，ANT1 與 TIM23 介導(dǎo)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子 TIM44 相互作用，而 ANT1 與 TIM44 的相互作用是 ANT1-TIM23 相互作用、抑制 TIM23 介導(dǎo)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以應(yīng)對(duì)生物能量崩潰和促進(jìn)有絲分裂的必要條件。

Ant1 缺失小鼠 (Ant1^KO mice) 的大腦和心臟線粒體自噬減弱，無(wú)論在轉(zhuǎn)錄組水平相同或者更高的情況下，PINK1 和 Pakin 的積累都比控制組顯著減少。觀察發(fā)現(xiàn)，Ant1^KO 小鼠的骨骼肌發(fā)生線粒體自噬嚴(yán)重缺陷。輕度肌肉疾病導(dǎo)致喪失 ADP/ATP 交換能力的患者，能通過重新表達(dá)野生型 Ant1 或者是 K33Q 缺陷 Ant1 都能恢復(fù)線粒體自噬，然而重度疾病 ADP/ATP 交換正�；颊咧斜磉_(dá) ANT1 (A90D) 仍不能恢復(fù)自噬，這與 Ant1^KO 小鼠線粒體和線粒體 DNA 的堆積結(jié)果一致。值得注意的是，核編碼的線粒體基因并未受到影響。缺乏 ANT1 引起了線粒體自噬功能喪失，在一名攜帶 ANT1 純合功能缺失突變患者的臨床癥狀以及線粒體觀察中得到驗(yàn)證。

圖 3. 體內(nèi)線粒體自噬需要 ANT1

小 M 的思考：

研究者的這一發(fā)現(xiàn)確定了 ANT 作為健康和疾病中線粒體自噬的基本介導(dǎo)者，為致病突變導(dǎo)致的線粒體穩(wěn)態(tài)相關(guān)疾病的研究提供了新思路。