PCR 核酸檢測技術(shù)原理和案例分析
首先我們需要知道：就現(xiàn)有檢測手段來說，檢測的是樣品中病毒核酸片段，而非完整的病毒核酸，更不是活病毒。新冠患者治愈后，活病毒被免疫系統(tǒng)清除，但是體內(nèi)可能仍然存在病毒核酸碎片，因此核酸檢測結(jié)果仍可能呈陽性。此時的陽性結(jié)果，不代表患者體內(nèi)一定存在完整的病毒核酸或者活病毒！
目前核酸檢測主要的操作是，采取咽拭子或鼻拭子，取樣后，做病毒核酸的實驗室檢測：提取標(biāo)本中的 RNA，并逆轉(zhuǎn)成 cDNA，用病毒 cDNA 的特異性引物進行 PCR 擴增。如擴增的產(chǎn)物，出現(xiàn)病毒特異性的 DNA，則病毒核酸檢測結(jié)果為陽性。
新型冠狀病毒 (SARS-CoV-2) 是一種 RNA 病毒，新冠病毒患者樣本含病毒的遺傳物質(zhì) RNA，核酸檢測大概率呈陽性。(核酸結(jié)果陰性也不能排除病毒感染，要結(jié)合癥狀、血常規(guī)及肺部 CT 等檢查，逐一分析，綜合判斷。）
PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))：基本原理類似于 DNA 的體內(nèi)復(fù)制，特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。新型冠狀病毒是一種 RNA 病毒，所以我們主要介紹一下 RT-PCR。
RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 提取組織或細胞中的總 RNA，以其中的 mRNA 為模板，采用 Oligo(dT) 或隨機引物，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。再以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。
基于 RT-PCR 進行的核酸檢測[1]
RT-PCR 可以定性，但不能定量。所以這里我們需要介紹一下它的升級版——實時熒光定量 PCR (Real-time RT-PCR)，就是結(jié)合了熒光定量技術(shù)的反轉(zhuǎn)錄 PCR：先從 RNA 反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，然后再用 Real-time PCR 進行定量分析。在反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個 PCR 進程。最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行總量分析或通過 Ct 值對模板進行相對定量分析。
◐ 實驗設(shè)計：
分別以 SYBR Green qPCR Master Mix、Primer 和 ddH2O 點樣跑電泳。
◐ 問題：
為什么單獨用 Mix 跑核酸電泳會有一個小條帶？
◐ 萌 Cece 解答：
此款 qPCR Mix 所用的酶為配體法修飾的熱啟動 DNA 聚合酶，該配體為核酸。因此直接用酶跑電泳時，會存在一個小條帶。
收！說了這么多，講重點！針對核酸檢測中的假陰性問題，有沒有完美的解決方案呢？
額~目前還沒有新冠檢測篩查金標(biāo)準(zhǔn)。所以聯(lián)合檢測手段是目前比較可靠的方式，即同時應(yīng)用 2 種或 2 種以上診斷方式來檢測。目前的檢測手段有鼻拭子和咽拭子、肺泡灌洗液檢驗、血液抗體檢測、糞便和肛拭子，及胸片/CT 等影像學(xué)等手段，還可以結(jié)合環(huán)境樣本和陰性對照做驗證排除。
做 PCR 時出現(xiàn)假陰性是什么原因呢，又該怎么應(yīng)對？別擔(dān)心，萌 Cece 有妙招！
■ 問題 1：模板問題
萌 Cece 分析解答：模板可能包含雜蛋白。建議配制穩(wěn)定有效的消化處理液。同時，模板的溶解液固定不變 (比如：Tris-HCl 緩沖液)。
■ 問題 2：引物問題
萌 Cece 分析解答：引物可能質(zhì)量不太好，或者濃度設(shè)計不合適，及引物設(shè)計不合理，如長度不夠，引物本身或兩條引物之間形成二聚體等。建議更換引物。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，以防止反復(fù)凍融或長期冷凍保存，導(dǎo)致引物的變質(zhì)降解失效。
■ 問題 3：Mg2+ 濃度
萌 Cece 分析解答：Mg2+ 濃度對 PCR 擴增效果影響極大，濃度過高可降低 PCR 擴增的特異性，過低則影響 PCR 擴增產(chǎn)量甚至使 PCR 擴增失敗，出現(xiàn)假陰性。建議設(shè)置一組反應(yīng)，每一反應(yīng)中的其他離子濃度相同 (如 Tris、KCl 等)，而 MgCl2 濃度不同，來摸索最佳濃度。
■ 問題 4：設(shè)計因素
萌 Cece 分析解答：變性溫度低，時間短；退火溫度過高，影響引物與模板的結(jié)合而降低擴增效率；延伸時間過短。建議提高變性溫度，延長變性時間，尤其首次循環(huán)。退火溫度應(yīng)根據(jù) Tm 值來設(shè)定。延伸時間必要時適當(dāng)延長。
除此之外，就是最討厭的“出現(xiàn)非特異性擴增帶”
萌 Cece 分析解答：Mg2+ 濃度過高，退火溫度過低，PCR 循環(huán)次數(shù)過多；酶的質(zhì)量不過關(guān)；引物與靶序列不完全互補，或引物聚合形成二聚體，都有可能出現(xiàn)非特異性擴增帶。建議適當(dāng)提高退火溫度；更換新酶；降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減小循環(huán)次數(shù)。必要時重新設(shè)計合成引物。
說這么多就不得不提一下我們 MCE 眾多的 Pre-Mix 即用型預(yù)混液，操作 so easy！
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相關(guān)產(chǎn)品 |
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2× 濃度的即用型預(yù)混液，含有 qPCR 的所有組分， 只需加入樣品 DNA，引物和水即可快速高效完成 qPCR 反應(yīng)。 |
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高效、快速的即用型預(yù)混液，含有反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的所有組分，只需加入 RNA 和 RNase-free H2O 即可快速高效完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 |
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RT Master Mix for qPCR (gDNA digester plus) 高效、快速的反轉(zhuǎn)錄試劑，含有反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的所有組分，只需加入 RNA 模板和 RNase-free H2O 即可快速高效完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并同時有終止 gDNA digester 的作用，保證 cDNA 的完整性。 |
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SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) 2× 濃度的即用型預(yù)混液，含有 qPCR 的所有組分， 只需加入樣品 DNA，引物和水即可快速高效完成 qPCR 反應(yīng)。本品內(nèi)含 High ROX Reference Dye，適用于需要校正孔間熒光信號誤差的儀器。 |
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SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) 2× 濃度的即用型預(yù)混液，含有 qPCR 的所有組分，只需加入樣品 DNA，引物和水即可快速高效完成 qPCR 反應(yīng)。本品內(nèi)含 Low ROX Reference Dye，適用于需要校正孔間熒光信號誤差的儀器。 |
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SYBR Green qPCR Master Mix (No ROX) 2× 濃度的即用型預(yù)混液，含有 qPCR 的所有組分， 只需加入樣品 DNA，引物和水即可快速高效完成 qPCR 反應(yīng)。本品不含 ROX Reference Dye，適用于無需校正孔間熒光信號誤差的儀器。 |
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高效、快速的 2× 濃度的即用型預(yù)混液 (含溴酚藍)，含有常規(guī) PCR 反應(yīng)所需的所有組分 (樣品 DNA，引物和水除外)。 |
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2× Fast PCR Master Mix (with Dye) 用于快速 PCR 擴增的 2× 濃度的即用型預(yù)混液 (含溴酚藍)，含有除樣品 DNA、引物和水外的所有 PCR 成分。 |
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2× High-Fidelity PCR Master Mix 新型高保真高效率的即用型 PCR 擴增預(yù)混液，適用于高難度長片段的 PCR 擴增實驗。 |
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參考文獻
1. Nidhi Verma, et al. Emerging diagnostic tools for detection of COVID-19 and perspective. Biomed Microdevices. 2020 Nov 24;22(4):83.
2. Wenling Wang, et al. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA. 2020 May 12; 323(18): 1843-1844.
