鐵死亡細胞實驗相關(guān)抑制劑、激動劑選擇方法
小白：害，買了抑制劑和激動劑，儲備液倒是配好了，可是不知道咋加藥。總不能一起懟進去細胞培養(yǎng)基吧？
師兄：鐵汁兒！事事有依據(jù)，要看文獻的。
上面的問題，相信很多初次接觸小分子抑制劑 (激動劑) 的小伙伴肯定會遇到。萌 Cece 我，作為一個小可愛，分享科研路上加藥三步法：明確實驗?zāi)康模墨I查閱濃度，初步嘗試后的調(diào)整。
下面， 我們來看看小白的“給藥闖關(guān)記”
小白有腎癌細胞系 786-O，實驗?zāi)康氖球炞C新買的藥物 Erastin 可以誘導(dǎo) 786-O 發(fā)生鐵死亡。于是小白文獻搜索，他打開了谷歌，輸入了關(guān)鍵字 cell 786-O Erastin，搜出了以下文獻。
小白若有所思地打開了其中一篇 Nrf2 represses ER stress-related ferroptosis in renal carcinoma cells via HO-1，在這篇文獻中，文獻作者使用不同濃度 (1-40 μM) 處理細胞 24 小時，MTT 法檢測細胞活力，結(jié)果表明 10 μM 時就表現(xiàn)出顯著性差異。而且該文中，作者還選用了 10 μM 這個濃度進行了細胞超微結(jié)構(gòu)觀察進一步確定鐵死亡。
當(dāng)然，勤快的小白還看了其他文獻。最后，小白用 1-40 μM 的濃度梯度，24 和 48 小時 2 個時間梯度進行實驗，并拿到了想要的實驗結(jié)果。
關(guān)卡二：一石二鳥
上面提到小白證明了 Erastin 誘導(dǎo) 786-O 細胞的鐵死亡。現(xiàn)在小白手里有個實驗室自己合成的藥物 X，未知是否具有保護細胞免受鐵死亡的作用。
小白又一次上了谷歌，輸入關(guān)鍵字：Erastin, ferroptosis, cell, protect, inhibitor。小白通過文獻查閱發(fā)現(xiàn)，不同的文獻中，要證明某種藥物對鐵死亡的保護作用，大多數(shù)情況下會將該藥物在誘導(dǎo)劑之前預(yù)處理，文獻中往往會出現(xiàn) (pretreatment, pretreated 等字眼)，當(dāng)然也不完全排除同時給藥的可能性 (with or without 等字眼)。不同文獻中的驗證方法也是“多姿多彩”。
首先，最簡單的是檢測細胞活力測定，如圖 3A，MTT 結(jié)果顯示，提前用不同抑制劑處理過的 786-O 細胞活力明顯上調(diào)。圖 3B 中，在原代胰島細胞中，使用乳酸脫氫酶測定法 (LDH release 為檢測指標) 進行細胞活力測定，結(jié)果表明 Ferrostatin-1，DFO 的提前預(yù)處理可明顯下調(diào) Erastin 誘導(dǎo)的 LDH 釋放。
其次較為常見的就是 ROS 測定與胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化測定。如圖 3C，SH-SY5Y 細胞中，Erastin 處理會導(dǎo)致細胞中 ROS 活性氧水平增加 (DCFH-DA 活性氧探針檢測)，但是鐵死亡抑制劑 DFO 會顯著減少 Erastin 誘導(dǎo)的活性氧增加。
圖 3D，Hela 細胞中，用 C11-BODIPY 染料進行脂質(zhì)活性氧測定，結(jié)果表明藥物預(yù)處理顯著增加脂質(zhì)活性氧的積累。
看完以上文獻，小白有了一些想法，他設(shè)置了以下分組 (Table 1. 小白的實驗分組)，并且在 MCE 購買了文獻中常用的鐵死亡抑制劑 Ferrostatin-1 作為陽性對照。根據(jù)文獻設(shè)置了不同時間梯度，又一次得到了想要的實驗結(jié)果。
拿到了上述結(jié)果后，新的問題又來了。小白需要沉默掉其他通路一個基因，驗證他的小分子化合物可能與該通路有關(guān)。那么現(xiàn)在至少有基因沉默，誘導(dǎo)劑，藥物 X 三個變量了！
小白又認真看了很多用到 siRNA，小分子化合物的文獻。如在 MDM2 and MDMX promote ferroptosis by PPARα-mediated lipid remodeling 這篇文獻中，作者目的是證明 MDMX 存在時，可獨立于 p53 促進細胞對鐵死亡的敏感度 (圖 4A)。Western Blotting 結(jié)果證明 siRNA 成功敲低 SK-Hep1 和 SK-Hep1 p53 KO 細胞中 Mdmx 的表達 (圖 4B)。使用 siRNA 敲低 MDMX 時，相對 siCtrl 組，在 SK-Hep1 以及 p53 KO 細胞中 Erastin 誘導(dǎo)的鐵死亡程度均被顯著降低 (圖 4C)。并且，siMDMX 的抑制作用不是短暫的，并且在給藥后至少 48 h 內(nèi)會持續(xù)一定程度 (圖 4D)。綜上所述，Erastin 誘導(dǎo)的鐵死亡需要 MDMX，而 MDMX 發(fā)揮作用獨立于 p53。
基于查到的文獻，小白將他的實驗優(yōu)化成了 2 步：先確保 siRNA 轉(zhuǎn)染成功，再加小分子化合物進行實驗。
熱火朝天的小白，再一次拿到的實驗結(jié)果。組會上，老師聽著小白的工作匯報，點頭露出欣慰的目光。真是一段充實的時光，小白從內(nèi)心發(fā)覺：實驗?zāi)康拿鞔_，多多查閱文獻，實驗過程中有的放矢的循序漸進，效果簡直絕絕子。
總結(jié)：
看著小白的實驗歷程，小 M 建議，無論做什么實驗，一定要明確心中所求，基于已經(jīng)發(fā)表的文獻中“取經(jīng)”，設(shè)計自己的實驗。其次，保持樂觀的心態(tài)，勝敗乃兵家常事，循序漸進，不斷改進，相信 SCI 在向你瘋狂招手。
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參考文獻
1. Yuanqing Shen, et al. Nrf2 represses ER stress-related ferroptosis in renal carcinoma cells via HO-1. Biorxiv
2. A M James Shapiro, Antonio Bruni et al. Ferroptosis-inducing agents compromise in vitro human islet viability and function. Cell Death Dis. 2018 May 22;9(6):595.
3. Xue Yao, Yan Zhang, Bao-You Fan, Yi-Lin Pang, et al. Neuroprotective effect of deferoxamine on erastininduced ferroptosis in primary cortical neurons. Neural Regen Res. 2020 Aug;15(8):1539-1545.
4. D Tang, X Sun, et al. HSPB1 as a novel regulator of ferroptotic cancer cell death. Oncogene. 2015 Nov 5;34(45):5617-25.
5. Divya Venkatesh, Nicholas A O'Brien, Fereshteh Zandkarimi, 1, Michael E Stokes, et al. MDM2 and MDMX promote ferroptosis by PPARα-mediated lipid remodeling. Genes Dev. 2020 Apr 1;34(7-8):526-543
師兄：鐵汁兒！事事有依據(jù)，要看文獻的。
上面的問題，相信很多初次接觸小分子抑制劑 (激動劑) 的小伙伴肯定會遇到。萌 Cece 我，作為一個小可愛，分享科研路上加藥三步法：明確實驗?zāi)康模墨I查閱濃度，初步嘗試后的調(diào)整。
下面， 我們來看看小白的“給藥闖關(guān)記”
關(guān)卡一：牛刀小試
小白有腎癌細胞系 786-O，實驗?zāi)康氖球炞C新買的藥物 Erastin 可以誘導(dǎo) 786-O 發(fā)生鐵死亡。于是小白文獻搜索，他打開了谷歌，輸入了關(guān)鍵字 cell 786-O Erastin，搜出了以下文獻。
圖 1. 關(guān)鍵字搜索相關(guān)文獻
小白若有所思地打開了其中一篇 Nrf2 represses ER stress-related ferroptosis in renal carcinoma cells via HO-1，在這篇文獻中，文獻作者使用不同濃度 (1-40 μM) 處理細胞 24 小時，MTT 法檢測細胞活力，結(jié)果表明 10 μM 時就表現(xiàn)出顯著性差異。而且該文中，作者還選用了 10 μM 這個濃度進行了細胞超微結(jié)構(gòu)觀察進一步確定鐵死亡。
當(dāng)然，勤快的小白還看了其他文獻。最后，小白用 1-40 μM 的濃度梯度，24 和 48 小時 2 個時間梯度進行實驗，并拿到了想要的實驗結(jié)果。
圖 2. Erastin 誘導(dǎo)鐵死亡
A: MTT 檢測細胞活力; B: 細胞超微結(jié)構(gòu)觀察
A: MTT 檢測細胞活力; B: 細胞超微結(jié)構(gòu)觀察
關(guān)卡二：一石二鳥
上面提到小白證明了 Erastin 誘導(dǎo) 786-O 細胞的鐵死亡。現(xiàn)在小白手里有個實驗室自己合成的藥物 X，未知是否具有保護細胞免受鐵死亡的作用。
小白又一次上了谷歌，輸入關(guān)鍵字：Erastin, ferroptosis, cell, protect, inhibitor。小白通過文獻查閱發(fā)現(xiàn)，不同的文獻中，要證明某種藥物對鐵死亡的保護作用，大多數(shù)情況下會將該藥物在誘導(dǎo)劑之前預(yù)處理，文獻中往往會出現(xiàn) (pretreatment, pretreated 等字眼)，當(dāng)然也不完全排除同時給藥的可能性 (with or without 等字眼)。不同文獻中的驗證方法也是“多姿多彩”。
首先，最簡單的是檢測細胞活力測定，如圖 3A，MTT 結(jié)果顯示，提前用不同抑制劑處理過的 786-O 細胞活力明顯上調(diào)。圖 3B 中，在原代胰島細胞中，使用乳酸脫氫酶測定法 (LDH release 為檢測指標) 進行細胞活力測定，結(jié)果表明 Ferrostatin-1，DFO 的提前預(yù)處理可明顯下調(diào) Erastin 誘導(dǎo)的 LDH 釋放。
其次較為常見的就是 ROS 測定與胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化測定。如圖 3C，SH-SY5Y 細胞中，Erastin 處理會導(dǎo)致細胞中 ROS 活性氧水平增加 (DCFH-DA 活性氧探針檢測)，但是鐵死亡抑制劑 DFO 會顯著減少 Erastin 誘導(dǎo)的活性氧增加。
圖 3D，Hela 細胞中，用 C11-BODIPY 染料進行脂質(zhì)活性氧測定，結(jié)果表明藥物預(yù)處理顯著增加脂質(zhì)活性氧的積累。
圖 3. 不同方法證明某藥物對鐵死亡的保護作用
A: 不同抑制劑提前預(yù)處理 786-O 細胞; B: 乳酸脫氫酶法測定細胞活力; C: ROS 探針檢測活性氧; D: 胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧的檢測
A: 不同抑制劑提前預(yù)處理 786-O 細胞; B: 乳酸脫氫酶法測定細胞活力; C: ROS 探針檢測活性氧; D: 胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧的檢測
看完以上文獻，小白有了一些想法，他設(shè)置了以下分組 (Table 1. 小白的實驗分組)，并且在 MCE 購買了文獻中常用的鐵死亡抑制劑 Ferrostatin-1 作為陽性對照。根據(jù)文獻設(shè)置了不同時間梯度，又一次得到了想要的實驗結(jié)果。
Table 1. 小白的實驗分組
關(guān)卡三：多重變量
拿到了上述結(jié)果后，新的問題又來了。小白需要沉默掉其他通路一個基因，驗證他的小分子化合物可能與該通路有關(guān)。那么現(xiàn)在至少有基因沉默，誘導(dǎo)劑，藥物 X 三個變量了！
小白又認真看了很多用到 siRNA，小分子化合物的文獻。如在 MDM2 and MDMX promote ferroptosis by PPARα-mediated lipid remodeling 這篇文獻中，作者目的是證明 MDMX 存在時，可獨立于 p53 促進細胞對鐵死亡的敏感度 (圖 4A)。Western Blotting 結(jié)果證明 siRNA 成功敲低 SK-Hep1 和 SK-Hep1 p53 KO 細胞中 Mdmx 的表達 (圖 4B)。使用 siRNA 敲低 MDMX 時，相對 siCtrl 組，在 SK-Hep1 以及 p53 KO 細胞中 Erastin 誘導(dǎo)的鐵死亡程度均被顯著降低 (圖 4C)。并且，siMDMX 的抑制作用不是短暫的，并且在給藥后至少 48 h 內(nèi)會持續(xù)一定程度 (圖 4D)。綜上所述，Erastin 誘導(dǎo)的鐵死亡需要 MDMX，而 MDMX 發(fā)揮作用獨立于 p53。
圖 4. 不同方法證明某藥物對鐵死亡的保護作用
A: MDMX 抑制劑作用機制簡圖; B: siRNA 沉默 Mdmx 表達; C: Erastin 誘導(dǎo)的 p53 KO 細胞鐵死亡; D: 細胞活力測定
A: MDMX 抑制劑作用機制簡圖; B: siRNA 沉默 Mdmx 表達; C: Erastin 誘導(dǎo)的 p53 KO 細胞鐵死亡; D: 細胞活力測定
基于查到的文獻，小白將他的實驗優(yōu)化成了 2 步：先確保 siRNA 轉(zhuǎn)染成功，再加小分子化合物進行實驗。
熱火朝天的小白，再一次拿到的實驗結(jié)果。組會上，老師聽著小白的工作匯報，點頭露出欣慰的目光。真是一段充實的時光，小白從內(nèi)心發(fā)覺：實驗?zāi)康拿鞔_，多多查閱文獻，實驗過程中有的放矢的循序漸進，效果簡直絕絕子。
總結(jié)：
看著小白的實驗歷程，小 M 建議，無論做什么實驗，一定要明確心中所求，基于已經(jīng)發(fā)表的文獻中“取經(jīng)”，設(shè)計自己的實驗。其次，保持樂觀的心態(tài)，勝敗乃兵家常事，循序漸進，不斷改進，相信 SCI 在向你瘋狂招手。
| 相關(guān)產(chǎn)品 |
| Erastin 鐵死亡 (ferroptosis) 誘導(dǎo)劑，結(jié)合且抑制電壓依賴性陰離子通道 (VDAC2/VDAC3)。 |
| Ferrostatin-1 選擇性的 ferroptosis 抑制劑，人工合成的抗氧化劑，通過還原機制來防止膜脂的損傷，從而抑制細胞死亡。 |
| Go 6983 PKC 的泛抑制劑，對 PKCα, PKCβ, PKCγ, PKCδ 和 PKCζ 均有效。 |
| CCK8 細胞活性和細胞毒性檢測的快速、高靈敏度試劑盒。 |
| MTT 可用于細胞增殖，活性毒性的檢測。 |
| H2DCFDA 用于檢測細胞內(nèi)活性氧 (ROS) 水平的探針。 |
參考文獻
1. Yuanqing Shen, et al. Nrf2 represses ER stress-related ferroptosis in renal carcinoma cells via HO-1. Biorxiv
2. A M James Shapiro, Antonio Bruni et al. Ferroptosis-inducing agents compromise in vitro human islet viability and function. Cell Death Dis. 2018 May 22;9(6):595.
3. Xue Yao, Yan Zhang, Bao-You Fan, Yi-Lin Pang, et al. Neuroprotective effect of deferoxamine on erastininduced ferroptosis in primary cortical neurons. Neural Regen Res. 2020 Aug;15(8):1539-1545.
4. D Tang, X Sun, et al. HSPB1 as a novel regulator of ferroptotic cancer cell death. Oncogene. 2015 Nov 5;34(45):5617-25.
5. Divya Venkatesh, Nicholas A O'Brien, Fereshteh Zandkarimi, 1, Michael E Stokes, et al. MDM2 and MDMX promote ferroptosis by PPARα-mediated lipid remodeling. Genes Dev. 2020 Apr 1;34(7-8):526-543
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