就是這么簡單！Octet和分子垂釣！
 
分子垂釣是生命科學(xué)研究中的常用手段，簡單來說就是從一個(gè)分子庫里（比如某個(gè)細(xì)胞裂解液的粗樣品）釣取可以與已知生物分子相結(jié)合的配體分子。一般先將這個(gè)已知分子偶聯(lián)在固相上面，然后和細(xì)胞裂解液里的物質(zhì)結(jié)合，最終將洗脫下樣品交由質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。
  
一個(gè)成功的垂釣實(shí)驗(yàn)會(huì)涉及到幾個(gè)重要因素
 
1     將已知分子牢固地偶聯(lián)到固相上，并保持其生物活性；
2     盡量減少混合樣品和固相之間的非特異性結(jié)合；
3     確保洗脫的物質(zhì)有足夠的量來做質(zhì)譜（濃度盡可能高，避免濃縮處理導(dǎo)致的損耗）；
4     對垂釣鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)用經(jīng)純化的樣品，再次通過分子互作技術(shù)進(jìn)行表征鑒定。
  
目前最常用的垂釣方法是Pull-Down，但是其缺點(diǎn)是非特異性高，操作麻煩。現(xiàn)在基于生物層干涉技術(shù)（BLI）的Octet分子互作儀器以及傳感器，針對這幾個(gè)問題進(jìn)行了積極的優(yōu)化和改進(jìn)，成為做分子垂釣的新方法。
 
今天陳老濕給大家介紹一篇文章，來自于意大利國家研究委員會(huì)下屬的生物結(jié)構(gòu)和生物成像研究所的。他們在研究中發(fā)現(xiàn)了針對某一腫瘤標(biāo)志物的抗體，并成功應(yīng)用BLI技術(shù)垂釣和鑒定出這個(gè)抗體的表位（抗體結(jié)合位點(diǎn)）【1】。
 
  Preferentially Expressed Antigen in Melanoma (PRAME，黑色素瘤特異性抗原) 是重要的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。科學(xué)家通過研究，發(fā)現(xiàn)了針對這個(gè)抗原的高親和力抗體。接下來的工作就是希望通過分子垂釣技術(shù)，對該抗體的識(shí)別表位開展鑒定工作。
 
下圖是做表位垂釣和鑒定的技術(shù)路線
 
1     先用BLI鑒定抗體與抗原結(jié)合。用胺基偶聯(lián)傳感器固化抗體，通過與抗原進(jìn)行結(jié)合解離得到的數(shù)據(jù)，確認(rèn)該抗體與抗原的結(jié)合親和力較高；
2     將抗原用胰蛋白酶消化成多肽，并用質(zhì)譜開展鑒定。通過同蛋白序列的分析對比，發(fā)現(xiàn)這些多肽序列的覆蓋率很高，從而確認(rèn)抗原預(yù)處理是成功的；
3     應(yīng)用Octet AR2G（胺基偶聯(lián)傳感器）固化抗體，抓取抗原消化產(chǎn)物，并用質(zhì)譜開展鑒定；
4     對鑒定得到的能與抗體結(jié)合的多肽序列進(jìn)行人工合成，并標(biāo)記上生物素標(biāo)簽；
5     采用Octet互作分析儀，用鏈霉親和素（SA）傳感器固化生物素化多肽，與抗體結(jié)合解離，鑒定多肽與抗體的親和力。


由此可見，Octet不僅可以作為整個(gè)抗原和表位多肽的親和力鑒定手段，同樣也是用于垂釣表位多肽的工具，兩全其美！
 
  作者將幾微升1μM濃度的抗原進(jìn)行消化后，將其與固化了抗體的AR2G傳感器在試管中孵育3分鐘。隨后用PBS緩沖液洗滌1分鐘，最后用0.1%的TFA洗脫（該洗脫液可以兼容質(zhì)譜）。重復(fù)該過程10次以確保積累足夠多的洗脫產(chǎn)物。
  BLI垂釣的質(zhì)譜鑒定結(jié)果：除去一些角蛋白的污染物多肽（K2,K3,K4）外，有一個(gè)PRAME（202-212）相關(guān)的多肽片段。

通過BLI技術(shù)發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了PRAME與抗體的潛在表位位置在202-212！另外，陳老濕必須提醒大家，在質(zhì)譜鑒定垂釣產(chǎn)物中，角蛋白相關(guān)多肽作為污染物被發(fā)現(xiàn)的概率非常高。因?yàn)檫@個(gè)蛋白大量存在于皮膚毛發(fā)中，所以其作為污染物可能在EP管等各種溶液容器中普遍存在，請大家在做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候盡量注意這點(diǎn)。
  BLI的傳感器還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是可以和PCR管完美配合。只要在PCR管里加入10ul左右的樣品或者洗脫液，并將傳感器直接插入試管，就可以輕松完成垂釣。
 
   潛在位點(diǎn)畢竟是潛在位點(diǎn)，垂釣畢竟是垂釣，對這個(gè)多肽與抗體的結(jié)合進(jìn)行進(jìn)一步鑒定是必不可少的。這個(gè)基于BLI技術(shù)的非標(biāo)記技術(shù)和直接結(jié)合（direct binding）又可以大顯身手了。BLI技術(shù)可直接對兩個(gè)生物分子之間進(jìn)行實(shí)時(shí)的相互作用檢測，最大程度保證結(jié)果的真實(shí)性。同時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測的結(jié)果能夠?yàn)檠芯空哒故鞠嗷プ饔玫倪^程，得到Kon、Koff、KD等重要的動(dòng)力學(xué)表征參數(shù)。Octet系統(tǒng)憑借測試速度快，步驟少，自動(dòng)化程度高，數(shù)據(jù)重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前市場上最主要的分子互作工具之一。
      應(yīng)用Octet開展分子垂釣的優(yōu)勢
1     提供多種傳感器固化已知分子
2     可以到達(dá)到ng級(jí)以上的洗脫量（如果傳感器上結(jié)合量夠大，做SDS-PAGE都?jí)�，請�?a >這里），并實(shí)現(xiàn)微量洗脫
3     提供較低非特異性吸附的基質(zhì)
4     通過直接結(jié)合實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證鑒定垂釣產(chǎn)物
5     易于操作，實(shí)驗(yàn)成本低 
 
   
-參考文獻(xiàn)-
【1】Development of a New Highly Selective Monoclonal Antibody against Preferentially Expressed Antigen in Melanoma (PRAME) and Identification of the Target Epitope by Bio-Layer Interferometry. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3166. https://doi.org/10.3390/ ijms22063166