細(xì)胞培養(yǎng)中常見的生物污染包括細(xì)菌污染、霉菌污染、支原體污染、黑點污染、真菌污染和原生動物污染。這些污染在細(xì)胞培養(yǎng)中的特點及相應(yīng)的解決辦法如下：

1.細(xì)菌污染
細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下呈黑色和細(xì)砂狀。根據(jù)感染菌的種類不同，可能會呈現(xiàn)不同的形狀，培養(yǎng)液一般會變得渾濁、黃色，對細(xì)胞生長有明顯影響。

 

解決方法：仔細(xì)檢查器具的滅菌情況，確保通風(fēng)時間和高壓滅菌器的壓力是否足夠。最重要的是，與培養(yǎng)基接觸的移液管等物品如果被污染兩次，則可能會導(dǎo)致儲存溶液也受到污染。所以一定要注意！下次使用前要檢查培養(yǎng)基的渾濁度。此外，建議在培養(yǎng)基中添加抗生素。

2.霉菌污染
正常情況下，培養(yǎng)基在 37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩三天，在倒置顯微鏡下仍保持透明，無雜質(zhì)。一旦出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，顯微鏡下可見絲狀和團(tuán)塊狀漂浮物，菌絲明顯。此時，雖然細(xì)胞仍在生長，但它們的生命狀態(tài)會在長時間后逐漸惡化。

 

 

解決方法：用硫酸銅溶液擦拭 CO2 培養(yǎng)箱，向托盤中加入飽和硫酸銅或消毒后加入飽和磷酸氫二鈉高鹽溶液，避免霉菌污染。

如果霉菌污染，暫時轉(zhuǎn)移所有細(xì)胞，并立即徹底使用 guo 氧乙酸溶液擦拭培養(yǎng)箱，包括層板和內(nèi)壁。將 guo 氧乙酸放在培養(yǎng)箱中一小時，使蒸汽擴(kuò)散，待 guo 氧乙酸氣味消散后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中。值得注意的是，培養(yǎng)箱需要每兩個月定期清洗一次，尤其是在梅雨季節(jié)。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精連續(xù)擦拭培養(yǎng)箱，用紫外線照射也是一種有效的方法。

為防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 兩性霉素、霉素抑制素、fang 線菌素 D 或青霉素鏈霉素。一旦被污染，就不可能恢復(fù)，即使使用上述抗生素，也沒有什么區(qū)別。對于支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)，最好選擇是丟棄污染的培養(yǎng)物，并用使用新鮮的無支原體的儲存液，徹底消毒環(huán)境。如果所有的細(xì)胞都被污染了，那可能是整個培養(yǎng)系統(tǒng)污染了。因此，必須對培養(yǎng)基和實驗設(shè)備進(jìn)行檢查。如果只是個別污染，可能是操作問題，有必要注意實驗操作步驟的規(guī)范。

3.支原體污染
支原體是隱蔽的污染物，不能通過過濾去除。顯微鏡下沒有任何可見的支原體污染跡象，比如細(xì)胞病變和濁度或 pH 值變化（即使在嚴(yán)重污染的培養(yǎng)基中），這樣就會導(dǎo)致我們產(chǎn)生錯誤的安全感。而在牛血清中，支原體是最常見的微生物之一。

 

 

解決方法：通常的過濾滅菌方法對支原體沒有影響。細(xì)胞一旦被支原體污染，特別是對重要的細(xì)胞系，必須去除支原體，一般的方法有抗生素治療、抗血清治療和抗血清與補(bǔ)體聯(lián)合治療。值得注意的是，支原體最突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細(xì)胞壁。因此，它對作用于細(xì)胞壁的生物合成抗生素（如 β-內(nèi)酰胺類、萬古霉素等）完全不敏感，并且通常對多粘菌素、利福平和磺胺類藥物具有耐藥性。相反，四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對支原體的抑制作用最強(qiáng)，而氨基糖苷類和氯霉素的抑制作用較弱。

4.黑點污染
黑色的游動點能穿透濾膜并在空氣中擴(kuò)散。它們在低倍鏡下顯示為黑色圓點，在高倍鏡下顯示為可移動的黑色斑點。培養(yǎng)液也不渾濁，一般影響較小，因此細(xì)胞仍可使用。通常，黑點污染后，細(xì)胞生長良好，運動物體無明顯增加，培養(yǎng)基的顏色和透明度無明顯變化。在同一批血清培養(yǎng)的細(xì)胞中也可以發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。

 

 

解決方法：黑點對細(xì)胞生長狀態(tài)沒有明顯影響，細(xì)胞增殖后會自然消失，因此除了血清置換外，無需特殊處理。如果細(xì)胞可能被小的運動點污染，建議增加培養(yǎng)皿細(xì)胞密度，以提高細(xì)胞存活率。

5.真菌污染
真菌污染后，培養(yǎng)基一般清澈，保持原色。細(xì)絲可以在顯微鏡下觀察到。最初，一些真菌類似于死細(xì)胞碎片，但其中許多清晰可見，看起來像珊瑚，比較容易區(qū)分。此外，它們會慢慢長出細(xì)細(xì)的黑色細(xì)絲，因為它們生長得比較慢，不像細(xì)菌那樣容易被發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基被污染，它們將很難存活。

 

 

解決方法：一旦被真菌污染，果斷丟棄，然后對細(xì)胞房、CO2 培養(yǎng)箱、器皿和培養(yǎng)基進(jìn)行徹底消毒。

6.原生動物污染
原生動物污染后，細(xì)胞培養(yǎng)基變得輕微渾濁。在顯微鏡下，大量的小點來回移動。雖然此時細(xì)胞仍能生長，但繁殖速度減慢，細(xì)胞生長狀態(tài)不好，邊緣不清，變得不透明。原生動物與細(xì)胞形成共生關(guān)系。同時，原生動物與細(xì)胞競爭營養(yǎng)。這種共生現(xiàn)象非常普遍，但以細(xì)胞為主，因為原生動物的數(shù)量相對較少，因而對細(xì)胞的正常生長沒有影響，只有當(dāng)它們達(dá)到一定數(shù)量時，才最終爆發(fā)成為惡性循環(huán)。

 

 

解決方法：原生動物污染的原因有很多，如液體消毒問題、操作問題、環(huán)境問題等，如果細(xì)胞足夠，果斷丟棄被污染的細(xì)胞和復(fù)蘇細(xì)胞。如果要保留，需要購買使用相關(guān)的滅菌試劑。