為指導(dǎo)各級疾控部門和其他相關(guān)機構(gòu)開展新型冠狀病毒肺炎病例標(biāo)本采集與實驗室檢測工作，特制定本技術(shù)指南。

 

一、標(biāo)本采集
（一）采集對象。
新型冠狀病毒肺炎疑似病例和聚集性病例，需要進行新型冠狀病毒感染診斷或鑒別診斷者，或其他需要進一步篩查檢測的環(huán)境或生物材料。

（二）標(biāo)本采集要求。
1.從事新型冠狀病毒檢測標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過生物安全培訓(xùn)（培訓(xùn)合格）和具備相應(yīng)的實驗技能。采樣人員個人防護裝備（Personal Protective Equipment，PPE）要求：N95及以上防護口罩、護目鏡、連體防護服、雙層乳膠手套、防水靴套；如果接觸了患者血液、體液、分泌物或排泄物，應(yīng)及時更換外層乳膠手套。
2.住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)院的醫(yī)護人員采集。
3.密切接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)刂付ǖ募部貦C構(gòu)、醫(yī)療機構(gòu)負(fù)責(zé)采集。
4.根據(jù)實驗室檢測工作的需要，可結(jié)合病程多次采樣。

 

（三）采集標(biāo)本種類。
每個病例必須采集急性期呼吸道標(biāo)本（包括上呼吸道標(biāo)本或下呼吸道標(biāo)本），重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道標(biāo)本；根據(jù)臨床需要可留取便標(biāo)本、全血標(biāo)本、血清標(biāo)本和尿標(biāo)本。
標(biāo)本種類：
1.上呼吸道標(biāo)本：包括鼻咽拭子、咽拭子等。
2.下呼吸道標(biāo)本：深咳痰液、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、呼吸道吸取物等。
3.便標(biāo)本/肛拭子：留取糞便標(biāo)本約10克（花生大�。�，如果不便于留取便標(biāo)本，可采集肛拭子。
4.血液標(biāo)本：盡量釆集發(fā)病后7天內(nèi)的急性期抗凝血，采集量5ml，建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管采集血液。
5.血清標(biāo)本：盡量釆集急性期、恢復(fù)期雙份血清。第一份血清應(yīng)盡早（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）釆集，第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第3～4周釆集。采集量5ml，建議使用無抗凝劑的真空釆血管。血清標(biāo)本主要用于抗體的測定，不進行核酸檢測。
6.尿標(biāo)本：留取中段晨尿，采集量2～3ml。

 

（四）標(biāo)本采集和處理。
1.鼻咽拭子：采樣人員一手輕扶被采集人員的頭部，一手執(zhí)拭子，拭子貼鼻孔進入，沿下鼻道的底部向后緩緩深入，由于鼻道呈弧形，不可用力過猛，以免發(fā)生外傷出血。待拭子頂端到達鼻咽腔后壁時，輕輕旋轉(zhuǎn)一周（如遇反射性咳嗽，應(yīng)停留片刻），然后緩緩取出拭子，將拭子頭浸入含2～3ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。
2.咽拭子：被采集人員先用生理鹽水漱口，采樣人員將拭子放入無菌生理鹽水中濕潤（禁止將拭子放入病毒保存液中，避免抗生素引起過敏），被采集人員頭部微仰，嘴張大，并發(fā)“啊”音，露出兩側(cè)咽扁桃體，將拭子越過舌根，在被采集者兩側(cè)咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，將拭子頭浸入含2～3ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。咽拭子也可與鼻咽拭子放置于同一管中。
3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采樣液沖洗收集器1次（亦可用小兒導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來替代收集器）。
4.深咳痰液：要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于含3ml采樣液的采樣管中。如果痰液未收集于采樣液中，可在檢測前，加入2～3ml采樣液，或加入痰液等體積的痰液消化液。痰液消化液儲存液配方見表1。

表1 痰液消化液儲存液配方
成分 質(zhì)量/體積
二硫蘇糖醇 0.1g
氯化鈉 0.78g
氯化磷 0.02g
磷酸氫二鈉 0.112g
磷酸二氫鉀 0.02g
水 7.5ml
PH值 7.4±0.2 （25℃）

使用時將儲存液用去離子水稀釋至50 ml，與痰液等體積混合使用，或者參照試劑說明進行使用，也可采用痰液等體積的含1g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液將痰液化。
5.支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用采樣液沖洗收集器1次，也可用小兒導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來替代收集。
6.肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經(jīng)過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支氣管，將其頂端契入支氣管分支開口，經(jīng)氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次30～50ml，總量100～250ml，不應(yīng)超過300ml。
7.糞便標(biāo)本：取1ml標(biāo)本處理液，挑取黃豆粒大小的便標(biāo)本加至管中，輕輕吹吸3-5次，室溫靜置10分鐘，以8000 rpm離心5分鐘，吸取上清液進行檢測。糞便標(biāo)本處理液可自行配制，配方見表2。

表2 糞便標(biāo)本處理液配方
成分 質(zhì)量/體積
Tris 1.211 g
氯化鈉 8.5 g
無水氯化鈣（或含結(jié)晶水的氯化鈣） 1.1 g （1.47 g）
水 800 ml
用濃鹽酸調(diào)節(jié) pH 為 7.5，以去離子水補充至 1000 ml也可使用HANK’S液或其它等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液溶解便標(biāo)本制備便懸液。如患者出現(xiàn)腹瀉癥狀，則留取糞便標(biāo)本3～5ml，輕輕吹打混勻后，以8000 rpm離心5分鐘，吸取上清液備用。
8.肛拭子：用消毒棉拭子輕輕插入肛門3～5cm，再輕輕旋轉(zhuǎn)拔出，立即放入含有3～5ml病毒保存液的15ml外螺旋蓋采樣管中，棄去尾部，旋緊管蓋。
9.血液標(biāo)本：建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管采集血液標(biāo)本5ml，根據(jù)所選用核酸提取試劑的類型確定以全血或血漿進行核酸提取。如需分離血漿，將全血1500～2000rpm離心10分鐘，收集上清于無菌螺口塑料管中。
10.血清標(biāo)本：用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清于無菌螺口塑料管中。
其他材料：依據(jù)設(shè)計需求規(guī)范采集。

 

（五）標(biāo)本包裝。
標(biāo)本采集后在生物安全二級實驗室生物安全柜內(nèi)分裝。
1.所有標(biāo)本應(yīng)放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷凍的樣本采集管里，擰緊。容器外注明樣本編號、種類、姓名及采樣日期。
2.將密閉后的標(biāo)本裝入密封袋，每袋限一份標(biāo)本。樣本包裝要求要符合《危險品航空安全運輸技術(shù)細(xì)則》相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。
3.涉及外部標(biāo)本運輸?shù)�，�?yīng)根據(jù)標(biāo)本類型，按照A類或B類感染性物質(zhì)進行三層包裝。

（六）標(biāo)本保存。
用于病毒分離和核酸檢測的標(biāo)本應(yīng)盡快進行檢測，可在24小時內(nèi)檢測的標(biāo)本可置于4℃保存；24小時內(nèi)無法檢測的標(biāo)本則應(yīng)置于-70℃或以下保存（如無-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存）。血清標(biāo)本可在4℃存放3天，-20℃以下可長期保存。應(yīng)設(shè)立專庫或?qū)９駟为毐４鏄?biāo)本。

 

（七）標(biāo)本送檢。
標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送往實驗室，如果需要長途運輸，建議采用干冰等制冷方式進行保藏。標(biāo)本運送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。
1.上送標(biāo)本
各�。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）5例及以上的聚集性病例，以及境外輸入病例的所有原始標(biāo)本上送中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所進行檢測復(fù)核，并附樣本送檢單（見附表）。
2.標(biāo)本及毒株運輸
2.1 國內(nèi)運輸
新型冠狀病毒毒株或其它潛在感染性生物材料的運輸包裝分類屬于A類，對應(yīng)的聯(lián)合國編號為UN2814，包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術(shù)細(xì)則》的PI602分類包裝要求；環(huán)境樣本屬于B類，對應(yīng)的聯(lián)合國編號為UN3373，包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術(shù)細(xì)則》的PI650分類包裝要求；通過其他交通工具運輸?shù)目蓞⒄找陨蠘?biāo)準(zhǔn)包裝。
新型冠狀病毒毒株或其它潛在感染性材料運輸應(yīng)按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定》（原衛(wèi)生部令第45號）辦理《準(zhǔn)運證書》。
2.2 國際運輸
在國際間運輸?shù)男滦凸跔畈《緲?biāo)本或毒株，應(yīng)規(guī)范包裝，按照《出入境特殊物品衛(wèi)生檢疫管理規(guī)定》辦理相關(guān)手續(xù)，并滿足相關(guān)國家和國際相關(guān)要求。
2.3 標(biāo)本和毒株管理
新型冠狀病毒標(biāo)本及毒株應(yīng)由專人管理，準(zhǔn)確記錄毒株和樣本的來源、種類、數(shù)量，編號登記，采取有效措施確保毒株和樣本的安全，嚴(yán)防發(fā)生誤用、惡意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。
 

二、新型冠狀病毒的實驗室檢測
（一）實時熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸。
1.新型冠狀病毒核酸檢測
本指南中的核酸檢測方法主要針對新型冠狀病毒基因組中
開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）。
靶標(biāo)一（ORF1ab）:
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
熒光探針（P）：
5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
靶標(biāo)二（N）:
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
熒光探針（P）：
5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
核酸提取和實時熒光RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考相關(guān)廠家試劑盒說明。
2.結(jié)果判斷
陰性:無Ct值或Ct為40。
陽性：Ct值<37，可報告為陽性。
灰區(qū)：Ct值在37-40之間，建議重復(fù)實驗，若重做結(jié)果Ct值
<40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性,否則為陰性。
注：如使用商品化試劑盒，則以廠家提供的說明書為準(zhǔn)。
3.病例確認(rèn)
實驗室確認(rèn)陽性病例需滿足以下兩個條件中的一個：
（1）同一份標(biāo)本中新型冠狀病毒2個靶標(biāo)（ORF1ab、N）實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果均為陽性。如果出現(xiàn)單個靶標(biāo)陽性的檢測結(jié)果，則需要重新采樣，重新檢測。如果仍然為單靶標(biāo)陽性，判定為陽性。
（2）兩種標(biāo)本實時熒光RT-PCR同時出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性，或同種類型標(biāo)本兩次采樣檢測中均出現(xiàn)單個靶標(biāo)陽性的檢測結(jié)果，可判定為陽性。
核酸檢測結(jié)果陰性不能排除新型冠狀病毒感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素，包括：樣本質(zhì)量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確的保存、運輸和處理樣本；技術(shù)本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。

 

（二）血清抗體檢測。
血清抗體檢測（膠體金、磁微�；瘜W(xué)發(fā)光、ELISA）用作新9型冠狀病毒核酸檢測陰性病例的補充檢測，在疑似病例診斷中與核酸檢測協(xié)同使用，或用于人群血清學(xué)調(diào)查和既往暴露調(diào)查。
實驗室確認(rèn)陽性病例需滿足以下兩個條件中的一個：
1.血清新型冠狀病毒IgM和IgG抗體陽性；
2.血清新型冠狀病毒IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期有4倍及以上升高。發(fā)病后7天內(nèi)的急性期抗凝血用于IgM和IgG檢測，如果檢測結(jié)果陰性，建議發(fā)病后10天內(nèi)再次采集進行檢測。發(fā)病后3-4周恢復(fù)期血清用于IgG檢測。如果采用商品化試劑盒，則以廠家明書為準(zhǔn)。

三、實驗室活動生物安全要求
根據(jù)目前掌握的新型冠狀病毒的生物學(xué)特點、流行病學(xué)特征、臨床資料等信息，該病原體暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進行管理，具體要求如下：
（一）病毒培養(yǎng)。
病毒培養(yǎng)是指病毒的分離、培養(yǎng)、滴定、中和試驗、活病毒及其蛋白純化、病毒凍干以及產(chǎn)生活病毒的重組實驗等操作。上述操作應(yīng)當(dāng)在生物安全三級實驗室的生物安全柜內(nèi)進行。使用病毒培養(yǎng)物提取核酸，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養(yǎng)等同級別的實驗室和防護條件下進行，裂解劑或滅活劑加入后可比照未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的防護等級進行操作。實驗室開展相關(guān)活動前，應(yīng)當(dāng)報經(jīng)國家衛(wèi)生健康委批準(zhǔn)，取得開展相應(yīng)活動的資質(zhì)。
（二）動物感染實驗。
動物感染實驗是指以活病毒感染動物、感染動物取樣、感染性樣本處理和檢測、感染動物特殊檢查、感染動物排泄物處理等實驗操作，應(yīng)當(dāng)在生物安全三級實驗室的生物安全柜內(nèi)操作。實驗室開展相關(guān)活動前，應(yīng)當(dāng)報經(jīng)國家衛(wèi)生健康委批準(zhǔn)，取得開展相應(yīng)活動的資質(zhì)。
（三）未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作。
未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作是指未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進行的病毒抗原檢測、血清學(xué)檢測、核酸提取、生化分析，以及臨床樣本的滅活等操作，應(yīng)當(dāng)在生物安全二級實驗室進行，同時采用生物安全三級實驗室的個人防護。
（四）滅活材料的操作。
感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進行的核酸檢測、抗原檢測、血清學(xué)檢測、生化分析等操作應(yīng)當(dāng)在生物安全二級實驗室進行。分子克隆等不含致病性活病毒的其他操作，可以在生物安全一級實驗室進行。