我太“南”了
 
PCR算是實(shí)驗(yàn)室最磨練耐心的實(shí)驗(yàn)之一了，好不容易完成了樣品準(zhǔn)備、核酸的提取，然而PCR之后沒有產(chǎn)物，是漏加了試劑，還是酶失活？換上新試劑，格外小心，重來一次，沒用��！，依然P不出條帶。內(nèi)心無比凄涼，悲傷逆流成河。
 
本來做個(gè)PCR研究都?jí)螂y了，現(xiàn)在還偏要碰到“困難模板”，小白不哭，沒有條帶不要著急，學(xué)姐總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，帶你攻克各路PCR困難模板。
 
高GC含量模板

難點(diǎn)
DNA序列中，G-C之間的三對(duì)氫鍵通常需要較高能量解鏈，模板很難打開，易形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，DNA聚合酶難以推進(jìn)。因此高GC含量（G+C>=60%）DNA序列在常規(guī)PCR條件下比較難擴(kuò)增。
解決方案

• 選用專門針對(duì)GC-RICH PCR系統(tǒng)試劑盒：
  包含高合成能力的DNA聚合酶，這類酶對(duì)DNA模板的親和力較高，更適合擴(kuò)增困難靶標(biāo)
• 添加1~2M betaine：
  betaine在PCR混合液里可以保護(hù)DNA聚合酶免被高溫變性傷害，還能促進(jìn)DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的穩(wěn)定，提高擴(kuò)增效率。
• 添加2~5% DMSO：
  DMSO可以降低DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。但DMSO也會(huì)降低Taq polymerase的活性，因此DMSO的使用濃度需要優(yōu)化。

 
產(chǎn)品推薦

貨號(hào)	產(chǎn)品描述
12140306001	GC-RICH PCR System	<<<點(diǎn)擊查看>>>
KK5702	2G Robust Hot Start Readymix	<<<點(diǎn)擊查看>>>
B0300	Betaine solution	<<<點(diǎn)擊查看>>>
D8418	DMSO for molecular biology	<<<點(diǎn)擊查看>>>

 
 
長片段模板

難點(diǎn)
長片段DNA序列在PCR過程中易損傷，使其斷裂或脫嘌呤，導(dǎo)致長片段PCR無法進(jìn)行。Taq酶具有一定的錯(cuò)配率，導(dǎo)致產(chǎn)物鏈3‘端出現(xiàn)錯(cuò)配堿基，鏈合成提前終止。非特異性擴(kuò)增也會(huì)干擾長片段的延伸。
解決方案

• 使用專為長片段PCR設(shè)計(jì)的PCR系統(tǒng)試劑盒：包含兼具矯正功能的DNA酶和高合成能力的DNA聚合酶，這類酶能夠在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增長片段。
• 設(shè)計(jì)較長的長片段PCR引物（21~34bp），提高反應(yīng)特異性，減少錯(cuò)配率。
• 適當(dāng)降低延伸溫度，同時(shí)根據(jù)模板長度加長延伸反應(yīng)時(shí)間（通常1kb/min）。
• 緩沖液體系需提高Tris的濃度或改用Tricine緩沖液以增強(qiáng)緩沖能力，使緩沖液的pH不會(huì)降的過低而影響酶活性。

 
產(chǎn)品推薦

貨號(hào)	產(chǎn)品描述
D1313	JumpStart™ REDAccuTaq® LA DNA Polymerase	<<<點(diǎn)擊查看>>>
11732650001	Expand High Fidelity PCR System	<<<點(diǎn)擊查看>>>
11681834001	Expand™ Long Template PCR System	<<<點(diǎn)擊查看>>>

 
低純度模板

難點(diǎn)
低純度模板中可能含有PCR抑制劑殘留，如蛋白酶K、苯酚和EDTA；殘留的鹽分或離子，如K⁺，Na⁺等也可能會(huì)抑制DNA聚合酶，從而影響PCR擴(kuò)增。
解決方案

• 選擇合成能力高，對(duì)抑制劑耐受力高的DNA聚合酶，比如，把野生型Ta酶通過Directed Evolution工程化修飾的KAPA2G DNA聚合酶。
• 使用70%乙醇再純化DNA，去除殘留鹽分或離子。
• 把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。
• 若存在EDTA或其它金屬螯合劑時(shí)，需要適當(dāng)提高能與EDTA結(jié)合的 Mg2+濃度。

 

貨號(hào)	產(chǎn)品描述
KK5024	KAPA2G Robust PCR Kit	<<<點(diǎn)擊查看>>>
KK7252	KAPA3G Plant PCR Kit	<<<點(diǎn)擊查看>>>
4655885001	Transcriptor One-Step RT-PCR Kit	<<<點(diǎn)擊查看>>>

 
 
低濃度模板

難點(diǎn)
模板濃度是決定Ct的最主要因素，需控制在一個(gè)合適范圍內(nèi)，使Ct在15-35之間。低濃度模板不僅會(huì)影響PCR效率降低得率，甚至無擴(kuò)增產(chǎn)物。
解決方案

• 選擇高靈敏度，高合成能力的DNA聚合酶。
• 避免樣制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。
• 再次擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，得到更高的目標(biāo)DNA得率。
• PCR擴(kuò)增無產(chǎn)物時(shí)，可以適當(dāng)提高Mg2+濃度（終濃度范圍：1~4 mM）。

 
產(chǎn)品推薦

貨號(hào)	產(chǎn)品描述
KK4601	KAPA SYBR® FAST	<<<點(diǎn)擊查看>>>
KK4702	KAPA PROBE FAST	<<<點(diǎn)擊查看>>>
4913914001	FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)	<<<點(diǎn)擊查看>>>

 
 
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