單細胞轉(zhuǎn)錄組研究是近期生命科學領域運用最火的組學檢測技術之一，來自麻省總醫(yī)院和哈佛醫(yī)學院的研究人員在《Molecular Cell》(Suva and Tirosh 2019)上討論了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術在腫瘤研究中的經(jīng)驗與未來挑戰(zhàn)。在此，我們對該review中的部分內(nèi)容進行解讀和分享。

作者認為，在接下來的幾年中，通過單細胞RNA-seq研究腫瘤的方法將進一步整合到癌癥研究中，并將用于解決越來越多關于腫瘤生物學的問題。在這里，作者簡要介紹一些可能解決的主要問題和scRNA-seq及其相關新興技術在其中的作用。

遺傳異質(zhì)性是在腫瘤之間和腫瘤內(nèi)產(chǎn)生多樣性的重要原因。然而，越來越多的證據(jù)表明非遺傳機制在其中的重要性。因此，在同一個細胞中映射細胞狀態(tài)和遺傳狀態(tài)就是一個重要的挑戰(zhàn)了。但是，現(xiàn)有大多數(shù)的scRNA-seq數(shù)據(jù)，基本忽略了細胞的遺傳狀態(tài)，或者只具有部分評估遺傳狀態(tài)的能力：（1）檢測靈敏度有限的RNA突變；（2）個體突變的靶向測序；（3）CNAs推測。因此，正在開發(fā)和改進的多組學技術來實現(xiàn)細胞狀態(tài)和遺傳學的聯(lián)合分析，有望對這些問題提出解決方案，比如，將mRNA檢測和蛋白，DNA甲基化，染色質(zhì)可及性，克隆擴增等同時進行檢測的多組學方式。
 

二．細胞-細胞相互作用和空間位置：空間分辨率的單細胞技術
 

 

每個腫瘤類似于生態(tài)系統(tǒng)，因此，每個細胞的狀態(tài)可能高度依賴于其精確的空間位置和與相鄰細胞的相互作用。 這些復雜的相互作用及其對癌細胞生物學的影響現(xiàn)階段仍然知之甚少。 將轉(zhuǎn)錄組與空間信息偶聯(lián)將顯著提高預測和進一步表征此類相互作用的能力。迄今為止，大多數(shù)scRNA-seq研究已經(jīng)檢測了細胞狀態(tài)但沒法還原其位置的任何信息。大多數(shù)情況下，只能根據(jù)數(shù)據(jù)特征來推斷出可能的組織位置信息。因此，用于腫瘤分析的空間分辨技術的不斷改進，以及來自不同技術的數(shù)據(jù)整合，將在未來幾年內(nèi)顯著推進這些方向，并提高我們對細胞-細胞相互作用和空間效應的理解。

除了空間分析之外，腫瘤內(nèi)細胞-細胞相互作用的研究將通過對配體和受體的表達分析來探究細胞間的相互交流。運用配體-受體復合物的數(shù)據(jù)庫，通過scRNA-seq數(shù)據(jù)與腫瘤細胞亞群的定義相結(jié)合，來推斷潛在的細胞-細胞相互作用，可以理解為其中一個群體產(chǎn)生配體，向另一個表達相應受體的群體發(fā)信號。當然，腫瘤微環(huán)境的復雜性，意味著這種潛在相互作用的數(shù)量很大，需要進行深入后續(xù)研究，才能確定個體相互作用的內(nèi)在機理。
 

三．殘留病變和復發(fā)：利用單核分析（冰凍材料）
 

在許多癌癥類型中，初始治療后通常伴隨著具有增強的侵襲性和抗藥性的復發(fā)，突出了殘留病變及其進展和生長對于建立復發(fā)性腫瘤的重要性。已有的研究比較了原發(fā)性和復發(fā)性腫瘤，并揭示耐藥性的各種遺傳原因。未來的研究將擴展這種方法，通過scRNA-seq進行比較，并提供更詳細的復發(fā)腫瘤視圖及其與相應原發(fā)腫瘤的區(qū)別。但是，一個重要的挑戰(zhàn)是，目前的scRNA-seq方案需要新鮮腫瘤樣本，在給定復發(fā)時間的情況下，為處理匹配的原發(fā)和復發(fā)樣本就比較困難了。不過，已有多種方法可以實現(xiàn)冷凍樣品的分析，如最近已有報道，可以通過單細胞核（而不是單細胞）的分離和測序來分析冷凍或固定的樣品。除了復發(fā)性腫瘤外，scRNA-seq還直接發(fā)現(xiàn)通過治療而存活的罕見殘留細胞，而它們正是最終成為腫瘤復發(fā)的基礎。 這種罕見細胞，通常被稱為微小殘留病變（MRD），可以在動物模型中進行分析，通過與原發(fā)性和復發(fā)性腫瘤進行比較，為其逃避治療的能力，保持休眠狀態(tài)，最后引起復發(fā)性腫瘤的過程提供了解釋。
 

腫瘤進展是一個進化過程，因此，只有少數(shù)細胞得以通過選擇而逐漸形成新的表型。所以，關鍵亞群，如癌癥干細胞，耐藥細胞和構成轉(zhuǎn)移的遷移細胞，可能反映了一種非常罕見的亞群（例如，小于0.1％）。然而，這種亞群大多數(shù)方法是檢測不到的，包括目前的scRNA-seq。不過，隨著目前單細胞檢測通量的不斷提高，像以微滴微流控為代表的技術，使得每批次檢測的細胞數(shù)據(jù)可以達到成千上萬。當然，未來的技術肯定會進一步地將這種能力提高到數(shù)萬甚至數(shù)百萬個細胞，這將大大地提高發(fā)現(xiàn)非常罕見亞群的可能。

當然，即使發(fā)現(xiàn)了這些獨特的亞群，它們的功能和臨床意義也是很難確定的。不過，有兩種重要的方法可以進一步分析這些亞群：1.大型列隊的研究可以揭示亞群存在和頻率與臨床特征（例如存活，轉(zhuǎn)移和藥物反應）之間的統(tǒng)計關聯(lián)。但是考慮到大樣本進行scRNA-seq的成本問題，目前相對可行的方法是利用已有可用的測序數(shù)據(jù)集（常規(guī)RNA測序或者單細胞測序），利用計算方法來找到數(shù)據(jù)特征和腫瘤的關聯(lián)；2.利用scRNA-seq數(shù)據(jù)，結(jié)合這些亞群的詳細細胞表型來鑒定能夠區(qū)分這些亞群的標記，同時在動物或者模型中做進一步的功能研究。最新的一些scRNA-seq研究就發(fā)現(xiàn)腫瘤表達譜與正常發(fā)育細胞之間的相似性，提出了關于腫瘤起源和其中發(fā)生的持續(xù)分化過程的具體假設。像人類圖譜計劃（HCA）這樣的對腫瘤，正常組織和發(fā)育過程進行scRNA-seq的研究，在未來將會做的更多更廣，也將有更多的發(fā)現(xiàn)。比如，對H3-K27M midline膠質(zhì)瘤的scRNA-seq發(fā)現(xiàn)惡性細胞與少突膠質(zhì)細胞前體細胞（OPCs）之間的相似性，與之前文獻報道的OPCs是該腫瘤的起源候選細胞結(jié)論一致。此外，惡性細胞和正常細胞之間的比較不僅突出了它們之間的相似性，還提供了腫瘤細胞和其假定的起源細胞之間差異的詳細數(shù)據(jù)，增進了我們對致癌過程的理解。
 

來源：Filbin et al., 2018
 

五．獨特的腫瘤表型和特殊反應群體：N = 1組的單細胞分析
 

盡管常規(guī)的治療決策是基于大群體的統(tǒng)計結(jié)果，但是異常值也是非常常見的，而且具有非常重要的作用。例如，“特殊反應者”表明了我們對治療反應和理論療效的局限性認識。在過去，我們通過對這些病例的bulk測序進行遺傳分析，但很難去理解他們的表型獨特性。隨著scRNA-seq等相關技術的發(fā)展，為我們理解這些獨特表型提供了可能。當我們發(fā)現(xiàn)特有表型時，針對這樣的N=1樣本進行scRNA-seq可能對于理解其表型的分子基礎非常有用。

長期以來，由于缺乏準確測量腫瘤中單個細胞的分析工具，腫瘤異質(zhì)性使得腫瘤生物學家和臨床醫(yī)生感到困惑。而腫瘤單細胞檢測技術的發(fā)展使得困惑可能得以一一解開。通過檢測單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，有可能為我們重新定義腫瘤起始和進化奠定理論基礎。通過對腫瘤中單細胞的全面分析，將有助于我們對腫瘤的了解和個性化治療。目前，人類腫瘤單細胞基因組學研究才剛剛興起，但隨著技術的發(fā)展，研究的不斷深入，將為我們更多的發(fā)現(xiàn)鋪平道路。

文獻來源
Suva, M. L. and I. Tirosh (2019). "Single-Cell RNA Sequencing in Cancer: Lessons Learned and Emerging Challenges." Mol Cell 75(1): 7-12.