組蛋白甲基化研究與表觀調(diào)控是腫瘤機制研究中的重要方向，然而傳統(tǒng)甲基化研究一般分四步走：尋找甲基化位點、分析甲基化位點與生物表型相關(guān)性、驗證甲基化調(diào)控靶基因表達量變化、構(gòu)建轉(zhuǎn)錄層面調(diào)控機制。

為更深入探索表觀調(diào)控與臨床現(xiàn)象間的具體機制，上海華盈生物合作伙伴——華中科技大學(xué)同濟醫(yī)院馬丁院士課題組以高分化惡性卵巢癌（HG-SOC）對順鉑耐藥為研究對象，為組蛋白甲基化和表觀調(diào)控提供了新的研究典范，相關(guān)研究成果近期發(fā)表在國際頂級學(xué)術(shù)期刊《Nature Communications》上。

文獻解讀

1、組蛋白甲基化，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因C/EBPβ

在HG-SOC組織中，研究人員應(yīng)用ChIP-seq技術(shù)對H3K4、H3K36、H3K79（轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)）和H3K9、H3K27、H4K20（轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)）六個甲基化位點進行基因?qū)用娴姆治�，結(jié)果顯示HG-SOC中許多基因的H3K79甲基化上調(diào)，并在IHC實驗中得到證實。RNA-seq結(jié)果表明HG-SOC中上調(diào)的基因與H3K79高甲基化相關(guān)，說明H3K79甲基化對于調(diào)控基因表達發(fā)揮重要作用。

進一步，利用生信軟件HOMER，研究人員找到與組蛋白甲基化相關(guān)的35個轉(zhuǎn)錄因子，其中CEBPB（編碼C/EBPβ蛋白）與H3K79甲基化上調(diào)成顯著相關(guān)性，見圖1。
 

圖1 HG-SOC表觀遺傳重編程轉(zhuǎn)錄因子

  
2、C/EBPβ高表達促進卵巢癌對順鉑耐藥

目前卵巢癌患者在臨床治療中遇到的主要障礙是耐藥性，導(dǎo)致患者預(yù)后較差。而C/EBPβ在不良預(yù)后病人中高表達，因此研究人員推測C/EBPβ與卵巢癌對順鉑耐藥相關(guān)。

利用TCGA數(shù)據(jù)庫和IHC實驗，對C/EBPβ和卵巢癌病人的順鉑耐藥可能性進行評估，結(jié)果顯示高表達的C/EBPβ與順鉑耐藥正相關(guān)。應(yīng)用C/EBPβ基因過表達和敲降技術(shù)，在細胞實驗和動物實驗同步證實：C/EBPβ過表達促進順鉑耐藥，而敲降C/EBPβ可以降低順鉑耐藥。此外，臨床卵巢癌患者在順鉑治療后，腫瘤組織中的C/EBPβ蛋白表達水平也有明顯上調(diào)，如圖2。

圖2  C/EBPβ與順鉑抗性分析

 
3、C/EBPβ與H3K79的甲基化調(diào)控

根據(jù)ChIP-seq實驗結(jié)果顯示，敲降C/EBPβ可以導(dǎo)致H3K79甲基化水平下調(diào)，進而可導(dǎo)致H3K79調(diào)控基因表達下調(diào)。研究人員在兩種不同的卵巢癌細胞系中分別敲降C/EBPβ并檢測H3K79的甲基化水平。通過RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)C/EBPβ敲降后，1238個基因發(fā)生上調(diào)，504個基因發(fā)生下調(diào)，其中9個與順鉑抗性相關(guān)基因的表達水平伴隨著H3K79甲基化的下調(diào)而降低。IPA分析顯示這些基因主要參與到順鉑抗性相關(guān)的DNA損失修復(fù)（DDR）信號和ERK5信號中，如圖3。

圖3  C/EBPβ調(diào)節(jié)H3K79甲基化重編程基因表達

 
4. 發(fā)現(xiàn)C/EBPβ調(diào)控H3K79甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L

根據(jù)ChIP-seq實驗結(jié)果，C/EBPβ靶向基因與DOT1L靶向基因具有顯著相關(guān)性，并且C/EBPβ結(jié)合位點與DOT1L結(jié)合位點距離接近，兩者有物理相互作用。經(jīng)過ChIP-qPCR驗證結(jié)果進一步證實，C/EBPβ通過增強DOT1L結(jié)合能力調(diào)節(jié)H3K79甲基化。應(yīng)用DOT1L抑制劑或shRNA進行體內(nèi)外抑制實驗，發(fā)現(xiàn)DOT1L抑制后，C/EBPβ高表達引起的順鉑耐藥性也隨之降低，見圖4。
 

圖4  C/EBPβ通過DOT1L調(diào)節(jié)H3K79甲基化

  
5、蛋白芯片：搭建甲基轉(zhuǎn)移酶與耐藥現(xiàn)象的橋梁

對于大多數(shù)甲基化研究者來說，能找到發(fā)揮顯著生物功能的甲基轉(zhuǎn)移酶已實屬不易。甲基化作為表觀調(diào)控的經(jīng)典方式，對生物表型的調(diào)控一般是通過對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控實現(xiàn)的。然而，靶基因mRNA的表達與生物表型間還存在著巨大的gap。如何迅速在找到能夠承接甲基轉(zhuǎn)移酶與生物表型間的蛋白或蛋白修飾功能分子？蛋白芯片技術(shù)可以完美對接...
       在本研究中，為進一步探討C/EBPβ-DOT1L引起順鉑耐藥的詳細機制，研究人員檢測DOT1L敲降后的23個C/EBPβ-DOT1L共調(diào)控靶基因，發(fā)現(xiàn)它們的表達均降低。而這其中就包括已證實的信號通路調(diào)控分子RICTOR (AKT-mTOR)、SLC38A1(AKT)、OSMR(STAT3)、LDLR(ERK)和HIF1A(EGFR)等。如果能夠證實EGFR、PI3K-AKT、JAK-STAT3、ERK等信號通路同步也受到抑制，C/EBPβ-DOT1L表觀調(diào)控與卵巢癌對順鉑耐藥的機理就得以完美解釋。
        面對復(fù)雜的信號通路篩選，研究人員果斷采用信號通路磷酸化廣譜芯片PCS248（一次芯片實驗即可完成12條信號通路磷酸化調(diào)變篩選），對C/EBPβ敲降組和對照組JAK-STAT、PI3K-AKT、MAPK等12條腫瘤通路進行廣泛分析，快速證實了自己提出的假說，為C/EBPβ-DOT1L促順鉑耐藥機理的探索畫上完美句號，即C/EBPβ與DOT1L形成復(fù)合物調(diào)控靶基因表達，進而促進腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)通路的活化導(dǎo)致臨床常用化療藥物順鉑在卵巢癌的治療過程中發(fā)生耐藥，見圖5。 

圖5  C/EBPβ引起順鉑抗性信號機制

小結(jié)：

該研究采用了經(jīng)典的甲基化研究思路，找到了甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物C/EBPβ-DOT1L在卵巢癌順鉑耐藥中發(fā)揮作用，通過蛋白芯片技術(shù)揭開了表觀調(diào)控與腫瘤耐藥之間的黑匣子，找到了明確的耐藥機制，為甲基化調(diào)控深入研究提供了典范。

 
英文文獻鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=C%2FEBP%CE%B2+enhances+platinum+resistance