細胞治療干貨|免疫細胞殺傷經典案例
在細胞治療過程中，評價免疫細胞的增殖能力，以其對靶細胞的殺傷能力是細胞治療過程中非常關鍵的環(huán)節(jié)。其中DELFIA® EuTDA細胞毒法和DELFIA® BrdU細胞增殖方法，憑借其高靈敏度、易操作性性等諸多優(yōu)勢，已逐漸成為主流的檢測技術。在此，通過以下一系列的應用案例，我們將向大家展示DELFIA® EuTDA、DELFIA® BrdU、活體影像及放射性檢測等方法如何助力免疫細胞殺傷研究。
一，CAR-T細胞殺傷
毫無疑問，CAR-T療法已成為當下最火的腫瘤細胞療法之一。同樣作為CAR-T大國，中國多數(shù)CAR-T療法已進入臨床研究，并且產業(yè)化發(fā)展迅速，而美國則還集中在臨床前研發(fā)[1]。
安全性是CAR-T療法的一大挑戰(zhàn)。除了細胞因子風暴外，CAR-T療法還會誘發(fā)移植物抗宿主反應 （graft versus host disease GVHD）等安全隱患。鑒于選擇性去除CD45RA陽性細胞能有效抑制GVHD發(fā)生[2]，研究利用CD45RA陰性T細胞群體開展靶向CD19的 CAR-T療法，來提高治療安全性。結合DELFIA的細胞殺傷檢測法和基于Calcein-AM標記的流式法，研究證明CD45RA陰性 CAR-T細胞能有效殺傷CD19陽性腫瘤細胞系，并能作用于原代NK細胞殺傷耐受的MLL重排白血病原始細胞SJ4-11（K562為敏感細胞對照，RS4;11為耐受細胞對照）[3]。
由于CD45RA-細胞主要為CD3+CD45O+記憶T細胞，因此針對常見的病原體和疫苗應有更好的回憶應答（Recall response）。通過使用DELFIA Cell Proliferation Assay 檢測摻入的BrdU，研究確認CD45RA- T細胞對人CMV、Epstein–Barr 病毒、 herpes simplex 病毒和tetanus toxoid有更為顯著的免疫反應（下圖a，增殖指標）�；谕瑯拥脑鲋硻z測平臺，研究利用PBMC開展Mixed lymphocyte reaction (MLR)，對比不同細胞亞群的同種異體反應。相較于CDRA-效應細胞群體，CD45RA+細胞在MLR實驗中具有更高的增殖能力（下圖b）和IFN-γ分泌能力（下圖c）[3]。
進一步的體內實驗研究繼續(xù)利用了PerkinElmer IVIS活體成像平臺，在白血病小鼠模型的基礎上，研究證明CD45RA-的 CAR-T療法在不誘導GVHD的同時，發(fā)揮強效的抗癌效果[3]。借助活體成像的優(yōu)勢，研究追蹤CD19+ SEM細胞在小鼠體內的擴增情況，確認在接種18天后腫瘤的信號強度足以模擬頑固性白血病小鼠模型。在此模型的基礎上CD45RA-的 CAR-T療法同樣能迅速發(fā)揮作用，兩周內強力抑制生物發(fā)光信號至檢測限以下。最后，基于同樣的檢測平臺結合重復接種腫瘤細胞，研究證明CD45RA-的 CAR-T療法還能作用于復發(fā)白血病小鼠模型。
二，CAR-NK細胞殺傷
CAR-T細胞療法的成功和興起也推動了其他類型的CAR研究，其中就包括針對實體瘤的CAR-NK療法。相較于T細胞，NK細胞可以在沒有抗體和MHC的幫助下靶向疾病細胞，因此能發(fā)動更為快速的免疫反應并能有效針對無MHC I表達的腫瘤細胞。同時, NK細胞更為安全，支持“Off-the-Shelf”的大規(guī)模生產和直接異體治療。目前在國內已有多家醫(yī)療企業(yè)推動CAR-NK治療，如博生吉的CD7 CAR-NK。
在6月份的Molecular Therapy期刊上，廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院的研究向我們展示了最新的CAR-NK臨床應用。為了特異靶向腫瘤細胞表面抗原NKG2DLs，研究在NKG2D受體的胞外結構域基礎上融合參與NK細胞活化的核心分子DAP12，并進一步通過RNA轉染途徑提升CAR-NK安全性。基于DELFIA的細胞殺傷檢測法，研究證明NKG2D-DAP12 (NKG2Dp)能有效的裂解多種腫瘤細胞系，優(yōu)于對照NK和NKG2D-CD3z(NKG2Dz)[4]。
借助Perkinelmer提供的HCT116-luc報告細胞系，研究通過活體成像方法，在體內水平證明CAR-NK能有效控制腫瘤發(fā)展。進一步的臨床研究證明CAR-NK的引入能迅速引起腫瘤退縮和腫瘤細胞減少，強調NKG2D CAR是一種很有前景的細胞治療方案[4]。
三，T細胞殺傷
T細胞不僅是免疫系統(tǒng)的核心成員，也是適應性免疫反應的基石。因此，T細胞功能的全面評價在腫瘤免疫療法的開發(fā)過程中至關重要，其中就包括腫瘤疫苗的研發(fā)。早期基于經典腫瘤相關抗原gp100的研究證明細胞因子RANTES的引入能顯著提升小鼠脾臟細胞的殺傷能力。同時，RANTES表達的時間點非常關鍵。疫苗引入前12和24小時表達RANTES能有效提升T細胞的殺傷能力，而48小時則沒有這個現(xiàn)象�；趧游飳嶒�，研究推測多種細胞參與殺傷，包括CD8+，NK細胞和CD4+細胞群體。進一步基于DELFIA細胞毒法研究證明TRAIL和FasL參與了殺傷過程[5]。
除了傳統(tǒng)T細胞殺傷外，DELFIA細胞毒法還可以被用于檢測靶向T細胞的新型免疫治療分子，如雙特異抗體(BiTE)等的細胞殺傷功能[6]。
四，NK細胞殺傷
鑒于NK細胞在天然免疫系統(tǒng)的重要性，其活力檢測也是免疫檢查點抑制劑研發(fā)過程中的核心項目。此外，NK細胞活力檢測還可以用于衡量用于免疫療法開發(fā)的新型小鼠模型。在2016年發(fā)表的一份研究中，基于DELFIA的細胞殺傷檢測法證明PD-1抗體可以顯著提升NOG-MHC Double Knockout小鼠脾中NK細胞靶向K562的殺傷活力。靶向免疫治療的新小鼠模型不僅能加速新型免疫檢查點藥物（組合）研發(fā)，同時可以協(xié)助發(fā)現(xiàn)新的標志物預測療效[7]。
除了直接殺傷靶細胞外，抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）也是評價NK細胞功能的一個關鍵指標。在今年的一份研究中，DELFIA細胞毒法被用于衡量靜脈注射免疫球蛋白( intravenous immunoglobulin, IVIG)對NK細胞功能的影響。從結果可以看出，除了阻斷NK細胞的直接殺傷能力外，IVIG幾乎完全抑制ADCC活力（下圖上）[8]。在該研究中，除了ADCC檢測外，Perkinelmer的放射檢測解決方案（3 [H]-Thymidine和MicroBeta 2）也被用于衡量IVIG和免疫抑制藥物對NK細胞增殖的影響。H3-摻入法證明相較于IVIG，免疫抑制藥物能有效抑制NK細胞增殖（下圖下），而IVIG則特異作用于T細胞活力。鑒于ADCC是單抗藥物發(fā)揮臨床效果的核心機制之一，其活力檢測也成為大分子藥物研發(fā)的必須環(huán)節(jié)[9]。
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[1] Jia Xin Yu, et al. The global pipeline of cell therapies for cancer. https://www.nature.com/articles/d41573-019-00090-z
[2] Triplett BM, et al. Rapid Memory T-cell Reconstitution Recapitulating CD45RA-depleted Haploidentical Transplant Graft Content in Patients with Hematologic Malignancies. Bone Marrow Transplant. 2015 Jul; 50(7): 968–977.
[3] Chan WK, et al. Chimeric antigen receptor-redirected CD45RA-negative T cells have potent antileukemia and pathogen memory response without graft-versus-host activity. Leukemia. 2015 Feb;29(2):387-95.
[4] Xiao L, et al. Adoptive Transfer of NKG2D CAR mRNA-Engineered Natural Killer Cells in Colorectal Cancer Patients. Mol Ther. 2019 Jun 5;27(6):1114-1125.
[5] Aravindaram K, et al. Transgenic expression of human gp100 and RANTES at specific time points for suppression of melanoma. Gene Ther. 2009 Nov;16(11):1329-39.
[6] Lewis SM, et al. Generation of bispecific igG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8.
[7] Ashizawa T, et al. Antitumor Effect of Programmed Death-1 (PD-1) Blockade in Humanized the NOG-MHC Double Knockout Mouse. Clin Cancer Res. 2017 Jan 1;23(1):149-158.
[8] Pradier A, et al. Small-Molecule Immunosuppressive Drugs and Therapeutic Immunoglobulins Differentially Inhibit NK Cell Effector Functions in vitro. Front Immunol. 2019 Mar 27;10:556.
[9] DELFIA經典技術應用于單抗研發(fā)及細胞治療——AD0116細胞殺傷專題之ADCC; https://mp.weixin.qq.com/s/0lkBdDHL5MFIyoeoFV4wWQ
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