試劑盒內(nèi)容及保存:
試劑盒組成 |
RTG2404-01(50次) |
貯存方式 |
緩沖液AP1 |
25 ml |
室溫 |
緩沖液AP2 |
10 ml |
室溫 |
緩沖液AP3(濃縮液) |
15 ml |
室溫 |
漂洗液PW(濃縮液) |
15 ml |
室溫 |
洗脫緩沖液EB |
15 ml |
室溫 |
RNase A(10 mg/ml) |
300μl |
-20℃ |
吸附柱CG(白色) |
50套 |
室溫 |
過濾柱CF |
50套 |
室溫 |
說明書 |
1份 |
|
● 儲存條件和效期:
本試劑盒在室溫(25℃左右)干燥條件下,可保存1年;更長時間的保存可置于2–8℃。2–8℃保存條件下,若溶液產(chǎn)生沉淀,應(yīng)在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。單獨(dú)包裝的RNaseA收到后-20℃保存。
● 產(chǎn)品簡介:
本試劑盒采用可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖液系統(tǒng),能提取多種植物細(xì)胞/組織中的基因組DNA。離心吸附柱可以高效、專一吸附DNA,可最大限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。提取的基因組DNA片段大,純度高,質(zhì)量穩(wěn)定可靠。
使用本試劑盒回收的DNA可適用于各種常規(guī)操作,包括酶切、PCR、文庫構(gòu)建、Southern雜交等實(shí)驗。
● 提取得率:
材料 |
DNA得量(μg/100mg) |
Arabidopsis |
3–4 μg |
Barley |
8–12 μg |
Maize |
15-20 |
Pine |
20-25 |
Potato |
4-6 |
Rape |
2-4 |
Spinach |
5-10 |
Tobacco |
20-25 |
Wheat |
25-30 |
● 準(zhǔn)備工作:
1. 準(zhǔn)備液氮;65℃水。粺o水乙醇;1.5ml滅菌離心管。
2. 按照標(biāo)簽所示在緩沖液AP3和漂洗液PW中加入無水乙醇,混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?br />
3. 每次使用前請檢查緩沖液AP1,緩沖液AP2和緩沖液AP3是否有沉淀生成,如果出現(xiàn)沉淀,37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。
● 操作步驟:
如非指出,所有離心步驟均為使用臺式離心機(jī)在室溫下離心。
1. 取適量植物新鮮組織500mg-1g加入液氮充分研磨,取約100mg粉末置于1.5ml離心管中,加入400 μl 緩沖液AP1和6 μl RNaseA (10mg/ml),漩渦震蕩1分鐘。
2. 將離心管放在65℃水浴10分鐘,水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次。
3. 加入130 μl 緩沖液AP2,顛倒混勻,冰浴5分鐘。
4. 12,000rpm離心5分鐘。
注:此步驟離心去除去垢劑,蛋白以及多糖等雜質(zhì)。
5. 取上清(通常為400 μl)轉(zhuǎn)移到過濾柱CF中,12,000rpm 離心1分鐘。
6. 將濾出液轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中,加入1.5倍體積(例如400 μl的上清液加600 μl緩沖液AP3)緩沖液AP3(使用前請注意是否已經(jīng)加入無水乙醇),立即顛倒混勻,簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
7.吸取步驟6中的混合液加入到吸附柱CG中(吸附柱放入收集管中),12,000 rpm離心1分鐘,倒掉廢液,吸附柱CG放回收集管中。
注:離心吸附柱的最大容積是700μl,如果一次不能完全上柱,可以分次上柱離心,保證全部溶液全部加到離心柱中。
8.向吸附柱CG中加入500 μl漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),12,000 rpm離心1分鐘,倒掉廢液,吸附柱CG放入收集管中。
9.重復(fù)步驟8。
10.
可選步驟:如果離心柱的吸附膜上有顏色,向吸附柱CG中加入500 μl無水乙醇,12,000 rpm離心1分鐘,倒掉廢液,吸附柱CG放入收集管中。
11.將吸附柱CG放回廢液收集管中,12,000 rpm離心2分鐘。
注:此步驟非常重要,目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、PCR等)實(shí)驗。
12.將吸附柱CG轉(zhuǎn)入一個干凈的1.5ml離心管中,向吸附膜的
中間部位懸空滴加50-100 μl經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB,室溫放置2分鐘,12,000 rpm g離心2分鐘。
注;1. 洗脫緩沖液體積最好不少于50 μl,體積過小影響回收效率。
2. 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi),pH值低于7.0會降低洗脫效率。
13. DNA產(chǎn)物-20℃保存。
● DNA濃度及純度檢測:
基因組DNA片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度?膳渲0.8-1.0%瓊脂糖凝膠,使用λ/HindIII判斷基因組的大小,完整的基因組大小應(yīng)在23kb以上。使用分光光度計檢測時, OD
260/OD
280比值應(yīng)為1.7–1.9之間,如果洗脫時不使用洗脫緩沖液,而使用去離子水洗脫,比值可能偏低,但并不表明DNA純度不高。