KinExA分子與完整細(xì)胞相互作用系統(tǒng)的原理與應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：7497　發(fā)布日期：2018-11-2　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

KinExA®分子與細(xì)胞相互作用系統(tǒng)介紹

一、KinExA的技術(shù)背景：

Sapidyne Instruments Inc.于1995年在美國(guó)創(chuàng)立，產(chǎn)品基于獨(dú)特的Kinetic Exclusion Assay（KinExA）專利技術(shù)。在公司成立早期，Xavier大學(xué)、美國(guó)陸軍和環(huán)境保護(hù)局等研究單位采用KinExA技術(shù)開展了大量工作；經(jīng)過數(shù)十年在生物制藥領(lǐng)域、科研領(lǐng)域及環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，KinExA技術(shù)已成為頂級(jí)制藥公司和生物技術(shù)公司以及許多大學(xué)、獨(dú)立研究實(shí)驗(yàn)室和環(huán)境監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)研究相互作用和生物活性物質(zhì)檢測(cè)的必備工具，并且已得到FDA和EMA認(rèn)可。

二、KinExA的技術(shù)原理：

在反應(yīng)溶液中當(dāng)受體和配體達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，這時(shí)溶液中存在三種物質(zhì)：受體、配體以及受體-配體復(fù)合物。KinExA技術(shù)通過包被受體或配體的珠子在極短時(shí)間內(nèi)（<0.5s，不影響反應(yīng)平衡）捕獲游離的配體或受體，再通過熒光標(biāo)記的抗體檢測(cè)游離的配體或受體的量。檢測(cè)過程如下：

三、KinExA與SPR的區(qū)別

1、與SPR的區(qū)別：SPR在芯片表面固定一個(gè)分子，通過芯片表明與溶液間二維相互作用的物質(zhì)量改變而實(shí)現(xiàn)SPR檢測(cè)。這就帶來了非常顯著的缺點(diǎn)：固定在芯片上的生物分子可能不能維持其天然活性、質(zhì)量遷移影響動(dòng)力學(xué)分析（例如，流速會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）、被檢測(cè)分子有分子量下限限制、非常大的分子或者生物結(jié)構(gòu)其分子量有上限限制、樣品需要純化及無法檢測(cè)完整細(xì)胞。相反，KinExA分析三維水平及游離狀態(tài)相互作用，不固定任何分子、不會(huì)對(duì)平衡帶來影響、沒有質(zhì)量遷移的限制、可以檢測(cè)未純化樣品和完整細(xì)胞；因此，極寬范圍內(nèi)的生物分子、生物結(jié)構(gòu)及完整細(xì)胞均可靈活分析。

2、與SPR技術(shù)對(duì)比：為了表征治療性單克隆抗體候選分子，研究者采用不同類型芯片，從Biacore系統(tǒng)獲得同一組單抗-抗原的53組數(shù)據(jù)，與KinExA實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，親和力及動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)與所使用的芯片類型有關(guān)，帶負(fù)電荷的CM5，CM4及CM1芯片對(duì)Biacore的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)有不利的影響。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者通過Biacore液相實(shí)驗(yàn)，KinExA平衡態(tài)滴定以及KinExA動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，精確計(jì)算抗體與抗原的親和力及動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明隨著芯片表面負(fù)電荷的降低，親和力及動(dòng)力學(xué)參數(shù)與液相實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果越接近�？赡艿脑颍海�1）帶負(fù)電荷的葡聚糖芯片與抗體之間的空間位阻影響抗原的結(jié)合；（2）帶負(fù)電荷的抗原與芯片表面的負(fù)電荷靜電排斥。

表中的結(jié)果說明：對(duì)于Biacore技術(shù)，不同的固定方式（氨基偶聯(lián)，捕獲）以及不同的芯片，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均有明顯影響。而采用KinExA技術(shù)，溶液中加葡聚糖，對(duì)結(jié)果也無明顯影響。

Drake A.W., et al. 2012. Biacore surface matrix effects on the binding kinetics and affinity of an antigen/antibody complex. Anal Biochem. 429(1):58-69.

四、KinExA的應(yīng)用：

應(yīng)用一、KinExA在CAR-T細(xì)胞治療中的應(yīng)用

因多種因素的限制，自體CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品可能在應(yīng)用于患者前未必能夠進(jìn)行全部項(xiàng)目的檢定，所以工藝驗(yàn)證非常重要。工藝研究及驗(yàn)證必須結(jié)合工藝的實(shí)際情況設(shè)定相應(yīng)的驗(yàn)證參數(shù)，CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品工藝研究在不斷發(fā)展，到目前為止，業(yè)界對(duì)何種工藝最好并未達(dá)成共識(shí)。因此，可以在產(chǎn)品研發(fā)過程及早期臨床試驗(yàn)階段開展不同程度的工藝驗(yàn)證研究，工藝驗(yàn)證完成后，應(yīng)在關(guān)鍵工藝步驟設(shè)置關(guān)鍵過程控制參數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)，以提高CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)一致性。

CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制研究及檢測(cè)項(xiàng)目一般應(yīng)包括：細(xì)胞數(shù)量及其存活率、細(xì)胞表型、CAR陽性率檢測(cè)、生物學(xué)效力檢測(cè)，無菌檢測(cè)、支原體、熱原/內(nèi)毒素的檢測(cè)、CAR-T細(xì)胞中病毒載體拷貝數(shù)及整合的檢測(cè)等。如果能夠檢測(cè)CAR-T細(xì)胞與抗原分子的親和力，以及CAR-T細(xì)胞上抗體的表達(dá)量，無疑會(huì)提升CAR-T細(xì)胞的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

目前市面上除了KinExA技術(shù)外，沒有其他特別有效的方式檢測(cè)完整細(xì)胞與分子間的親和力，更無從判斷細(xì)胞上分子的表達(dá)量。KinExA技術(shù)可以檢測(cè)細(xì)胞與分子間的親和力，并且可以計(jì)算細(xì)胞上分子的表達(dá)量。其檢測(cè)原理如下圖，先將梯度稀釋的細(xì)胞與恒定濃度的分子共同孵育達(dá)到平衡，離心之后收集上清液（此時(shí)上清液中只存在游離的分子），再通過已提前包被過的珠子捕獲游離的分子，用熒光標(biāo)簽的抗體檢測(cè)游離分子的量，通過檢測(cè)器檢測(cè)得到相應(yīng)的數(shù)值后，利用KinExA系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

下圖是國(guó)內(nèi)某知名CAR-T公司通過KinExA技術(shù)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞與抗原分子間相互作用的結(jié)果。

結(jié)果表明，CAR-T細(xì)胞與抗原的親和力Kd為45.41pM，T細(xì)胞表面CAR的表達(dá)水平為1.368e+5，Kd與EL的95%置信區(qū)間均較窄，數(shù)據(jù)非常準(zhǔn)確可信。

應(yīng)用二、KinExA在高親和力檢測(cè)上應(yīng)用

對(duì)于抗腫瘤藥市場(chǎng)，目前精準(zhǔn)醫(yī)療最為成熟的領(lǐng)域還是以靶向藥物為代表的抗腫瘤藥物。由于單克隆抗體類抗癌藥的副作用較小，且靶向性更好，因此，單抗藥物仍將是引領(lǐng)抗腫瘤藥物發(fā)展最為重要的領(lǐng)域。以PD-1為靶點(diǎn)的一類單抗藥呈現(xiàn)出較高的親和力，常規(guī)的相互作用檢測(cè)系統(tǒng)例如SPR 、BLI、ITC等由于自身原理的限制均不能檢測(cè)高親和力（pM級(jí)別）。KinExA技術(shù)有別于常規(guī)的相互作用檢測(cè)系統(tǒng)，能準(zhǔn)確有效的檢測(cè)高親和力（fM級(jí)別）。

下表是Pfizer, Rinat兩家公司聯(lián)合發(fā)表的KinExA高親和力檢測(cè)范圍的文章。

Bee C., et al. 2012. Exploring the dynamic range of the kinetic exclusion assay in characterizing antigen-antibody interactions. PLOS ONE 7(4): e36261.

五、案例分析

案例一：完整細(xì)胞的相互作用檢測(cè)

背景：單克隆抗體XMetA是胰島素受體（IR）變構(gòu)部分的激動(dòng)劑，其激活代謝Akt激酶信號(hào)通路，而對(duì)有絲分裂胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路幾乎沒有影響。為了研究這種選擇性信號(hào)通路的性質(zhì)，作者驗(yàn)證了XMetA對(duì)CHO細(xì)胞中IR，Akt和ERK的特異性磷酸化和活化的影響。

目的：完整細(xì)胞親和力檢測(cè)。

方法：研究者將表達(dá)短鏈型（IR-A）及長(zhǎng)鏈型（IR-B）胰島素受體的不同濃度CHO細(xì)胞分別與XMetA孵育，通過離心獲得游離的XMetA，用KinExA儀器檢測(cè)親和力。另外，作者采取同樣的策略，用KinExA儀器檢測(cè)胰島素與CHO細(xì)胞表面IR-A，IR-B的親和力。

結(jié)論：XMetA與IR-A亞型的親和力為55±16pM，與IR-B亞型的親和力為50±11pM。另外，在對(duì)照抗體組，胰島素與IR-A亞型的親和力為156±14pM；在XMetA組，胰島素與IR-A亞型的親和力為216±100pM；在對(duì)照抗體組，胰島素與IR-B亞型的親和力為221±28pM；在XMetA組，胰島素與IR-B亞型的親和力為277±112pM。數(shù)據(jù)同時(shí)說明， XMetA與IR亞型的結(jié)合與胰島素?zé)o關(guān)。

Bedinger, D., et al. 2015. Differential pathway coupling of activated insulin receptor drives signaling

selectivity by XmetA, an allosteric partial agonist antibody. J Pharmacol Exp Ther 353(1):35-43.

案例二：細(xì)胞與上清未純化樣品檢測(cè)

背景：單克隆抗體（mAb）在體內(nèi)與膜蛋白間親和力的可靠評(píng)估是腫瘤治療的主要問題。在BV展示系統(tǒng)中，膜蛋白能以天然狀態(tài)在病毒表面展示。

目的：細(xì)胞與上清中未純化樣品親和力檢測(cè)。

方法：研究者基于KinExA技術(shù)，結(jié)合桿狀病毒（BV）膜蛋白展示系統(tǒng)，描述了一個(gè)簡(jiǎn)單而高度敏感的單克隆抗體評(píng)估方法。

結(jié)論：在BV表面展示的肝癌抗原Robo1吸附到磁珠上（BV beads）,其KD值(~10pM)與全細(xì)胞分析方法一致（R2=0.998），表明基于KinExA技術(shù)檢測(cè)方法提供了針對(duì)細(xì)胞表面蛋白的單克隆抗體親和力準(zhǔn)確的評(píng)估。

Kusano-Arai 0., et al. 2016. Kinetic exclusion assay of monoclonal antibody affinity to the membrane protein Roundabout 1 displayed on baculovirus. Anal Biochem.

案例三：高親和力檢測(cè)

背景：白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）是炎癥反應(yīng)的有效介質(zhì)，在許多淋巴細(xì)胞的分化中發(fā)揮調(diào)控作用。在一些炎癥和自身免疫性疾病中，血清中IL-1β水平與疾病的發(fā)展和嚴(yán)重程度相關(guān)。 IL-1β在一些疾病中的機(jī)理已經(jīng)被臨床試驗(yàn)證實(shí)，并獲得FDA的審批。

目的：高親和力檢測(cè)與驗(yàn)證。

方法：設(shè)計(jì)抗IL-1β抗體XOM052，SPR檢測(cè)其與IL-1β的親和力為≤4pM。另外實(shí)驗(yàn)采用Protein A捕獲IL-1β抗體，解離10min，發(fā)現(xiàn)時(shí)間不足以使抗體抗原發(fā)生解離，將解離時(shí)間延長(zhǎng)至4h，解離早期無法準(zhǔn)確擬合，推測(cè)是由于IL-1β抗體從Protein A上解離對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的影響。為了更精確的計(jì)算親和力，作者改用KinExA，分析得到其親和力為300fM。

結(jié)論：KinExA技術(shù)對(duì)于高親和力的檢測(cè)具有無可替代的優(yōu)勢(shì)。