簡介

開發(fā)更復(fù)雜的、生物相關(guān)的和預(yù)測的基于細(xì) 胞的化合物篩選方法是藥物發(fā)現(xiàn)中的一個(gè)主 要挑戰(zhàn)。三維 (3D) 分析模型的開發(fā)和集成 正變得越來越流行，并驅(qū)動著生物轉(zhuǎn)化學(xué) 的發(fā)展。具體而言，3D 培養(yǎng)物具有精致濃 縮了人體組織各方面特征的優(yōu)點(diǎn)，包括結(jié) 構(gòu)、細(xì)胞組織、細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相 互作用，以及更多生理相關(guān)的特征延伸。

水凝膠廣泛用于模擬在 3D 環(huán)境中生長的神 經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)。水凝膠是聚 ( 乙二 醇 ) (PEG) 為基礎(chǔ)，完全合成的，全透明 的物質(zhì)。水凝膠通過摻入 MMP 切割位點(diǎn) 來幫助細(xì)胞遷移，并包含 RGD 細(xì)胞粘連基 序以支撐細(xì)胞的粘附作用。完全合成的水 凝膠是預(yù)先鋪展在 96 孔板中，其特征在 于深層次的密度梯度促進(jìn)細(xì)胞在水凝膠表 面上進(jìn)行三維滲透 ( 3D ProSeedTM 水凝 膠，ECICA 技術(shù) )。這種水凝膠預(yù)制板使 用方法簡便，同時(shí)能很好的兼容自動化設(shè) 備 ( 圖 1 )。 

同時(shí)，人類誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞 (iPSC) 衍生 的神經(jīng)元也越來越多地用于生理細(xì)胞模型 的開發(fā);與用于神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用的原代細(xì)胞和 動物模型相比，它們的人類起源，更長久 的再生能力和無限量的可用性使它們在神 經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)應(yīng)用中獨(dú)具優(yōu)勢。 

在多孔板中形成 3D 神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò) 

我們優(yōu)化了 96 孔板的細(xì)胞培養(yǎng)和染色，并 發(fā)展了完善的共聚焦成像及分析方法，讓 神經(jīng)元以 3D 模型的形式進(jìn)行形態(tài)表型和生 存能力的測量用于測定的細(xì)胞是 CN.4UTM (Axiogen AG)，是由神經(jīng)元 ( 谷氨酸能、多巴胺能和 GABAergic ) 和星形膠質(zhì)細(xì)胞組成的人 iPSC 誘導(dǎo)細(xì)胞混合體。CNS.4UTM 細(xì)胞在 3D ProSeedTM 水凝膠 (Ectica Technologies) 中孵育 14 天。細(xì)胞以 40000 個(gè)神經(jīng)元每 孔的密度培養(yǎng)在 200 μl 培養(yǎng)基中。對于選 定的研究，也評估了細(xì)胞接種密度的影響 ( 5000 ～ 8000 個(gè)細(xì)胞/孔 )。培養(yǎng)基的組 成包括 50:50 混合神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + DMEM / F12 + 補(bǔ)充劑 (Axiogenesis)。 

細(xì)胞接種在水凝膠的表面，然后滲透到水 凝膠內(nèi)部 ( 圖1 )。神經(jīng)突起生長開始于種 植后 24 h，接著連續(xù)培養(yǎng) 14 天以上。通 過透射光成像監(jiān)測神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成過程。 對于端點(diǎn)測量，使用 4% 甲醛固定細(xì)胞， 然后用 0.1% 的 Triton X-100 通透，并用 熒光抗體結(jié)合抗體對 TUJ-1 神經(jīng)元標(biāo)記物 染色，加上 Hoechst 核染色。

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