傳統(tǒng)的活體光學(xué)熒光成像（FLI）采用一個(gè)激發(fā)濾光片和一個(gè)發(fā)射濾光片。這對(duì)于區(qū)分靶向信號(hào)、可能存在的報(bào)告基因信號(hào)以及自體熒光組織信號(hào)而言有著諸多局限。多光譜（MS）FLI 采用多個(gè)激發(fā)濾光片和單個(gè)發(fā)射濾光片，或單個(gè)激發(fā)濾光片搭配多個(gè)發(fā)射濾光片，可以產(chǎn)生獨(dú)特的熒光區(qū)域或材料的光譜曲線。（1）因此，圖像上每一個(gè)像素點(diǎn)的熒光組分可以由此來(lái)確認(rèn)（圖 1）。

選擇活體MS FLI 有兩大原因：

1-在組織自體熒光的特定范圍內(nèi)對(duì)波長(zhǎng)較短的報(bào)告基因進(jìn)行成像時(shí)，可以抑制自體熒光背景信號(hào)。

2-在利用帶有重疊譜的波長(zhǎng)較長(zhǎng)的報(bào)告基因（如 NIR）進(jìn)行成像

時(shí)，可以抑制交叉反應(yīng)對(duì)獨(dú)特的報(bào)告基因?qū)崿F(xiàn)清晰的檢測(cè)。

為了了解這兩大原因，首先有必要了解小鼠組織自體熒光的基礎(chǔ)知識(shí)，及其在熒光光譜不同范圍中的成像。下圖 2 顯示了在采用綠/紅、藍(lán)/綠濾光片和 NIR 濾光片組合（2）時(shí)小鼠組織典型的天然自體熒光特性。值得注意的是綠/紅和藍(lán)/綠濾光片表現(xiàn)出較高的組織自體熒光水平，但 NIR 濾光片成像表現(xiàn)出的組織自體熒光相對(duì)較少。在使用綠色熒光蛋白（GFP）、紅色熒光蛋白（RFP）等報(bào)告基因、異硫氰酸熒光素（FITC）和 Alexa 600 時(shí)應(yīng)用MSFLI可以有效地減少組織自體熒光。而遠(yuǎn)紅（650-700 nm）或近紅外（NIR; 700-900 nm）熒光團(tuán)作為替代方案，因?yàn)樵诖斯庾V范圍內(nèi)皮膚自發(fā)熒光作用較小，但需要多重濾光片（3）。這種方法可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)分子標(biāo)志物，例如 熒光細(xì)胞示蹤報(bào)告探針和 熒光 蛋白酶活力報(bào)告探針等。此外，鼠類食物經(jīng)常包含含葉綠素的植物材料，可能在低 NIR 光譜中產(chǎn)生強(qiáng)烈的自體熒光。多光譜成像常常用于抑制這種胃腸道（GI）自體熒光，避免因成像研究而將飼料更換為無(wú)紫苜蓿的鼠類飼料。

布魯克系統(tǒng)采用“基于激發(fā)”的多光譜成像方式。其中，多個(gè)激發(fā)濾光片和單個(gè)發(fā)射濾光片被用來(lái)捕獲“疊合圖像”。對(duì)于包括基因熒光蛋白報(bào)告在內(nèi)的大多數(shù)有機(jī)熒光團(tuán)而言，激發(fā)光譜可以比發(fā)射光譜（圖 3）提供更多的信息，而與基于發(fā)射的多光譜成像相比，基于激發(fā)的多光譜成像能夠更好地捕獲這些不同的信息。

系統(tǒng)共配置 28 個(gè)激發(fā)濾光片。在定義發(fā)射濾光片前，應(yīng)該為給定的成像實(shí)驗(yàn)選擇最佳激發(fā)濾光片。而為了更好地選擇濾光片，事先比對(duì)用于成像的報(bào)告基因的激發(fā)光譜曲線的熒光光譜差異是非常有用的。在下方（圖 4）Alexa 680 和 Alexa 700 的例子中，二者在 520 和 720 nm 之間的激發(fā)光譜存在明顯差異。（了解 Alexa 680 和Alexa 700 濾光片選擇和建模的完整內(nèi)容，請(qǐng)查看網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)： https://youtu.be/iEyLl3qAzpA)。

系統(tǒng)配置 6 個(gè)發(fā)射濾光片（535 nm、600 nm、700 nm、750 nm、790 nm 和 830 nm）。通常選擇在波長(zhǎng)最長(zhǎng)的激發(fā)濾光片60 nm 內(nèi)不重疊的發(fā)射濾光片。所選發(fā)射濾光片無(wú)需與熒光發(fā)射的峰值一致，濾光片應(yīng)優(yōu)先選擇覆蓋特異熒光光譜的激發(fā)濾光片。繼續(xù)以 Alexa 680 和 700 成像為例，由于 535、600、700 和 750 nm 濾光片帶寬范圍與選定的激發(fā)濾光片范圍（圖 5）重疊，因此這里可以選擇 790 nm 的濾光片。

在“捕獲（Capture）”對(duì)話框中（圖 6）中支持選擇多個(gè)激發(fā)濾光片用于采集編程。應(yīng)該把多光譜采集作為之后多光譜建模和/或分離實(shí)驗(yàn)方法的一部分進(jìn)行。

啟始成像和研究設(shè)置包括用于優(yōu)化設(shè)置和建模的初始步驟：

1- 熒光團(tuán)成像（體外）

2- 生成光譜模型

3- 體內(nèi)模型評(píng)估

首先，我們建議您使用上文確定的濾光片對(duì)稀釋后的熒光團(tuán)進(jìn)行成像。一旦采集到圖像，通過(guò)將高斯曲線擬合到熒光團(tuán)的實(shí)驗(yàn)曲線來(lái)創(chuàng)建光譜曲線（圖7）。

一旦光譜曲線實(shí)現(xiàn)了優(yōu)化，模型就可以直接被調(diào)用到之后的數(shù)據(jù)集里，無(wú)需修改。如需將現(xiàn)有模型應(yīng)用到新的數(shù)據(jù)集中，則選擇“分離圖像”面板中的“+”，選擇所需模型和“分離（Unmix）”按鈕（見(jiàn)圖 8）。系統(tǒng)采用適合求解多光譜模型的最小二乘法，將模型分配給各個(gè)像素（4）。為此，每個(gè)像素中的光譜總和需要與參考圖譜庫(kù)中的所有可能的組合總和相匹配。分離算法還添加了一些額外的限制（如非負(fù)性）。因此，成功進(jìn)行光譜分離的關(guān)鍵就在于獲取圖譜庫(kù)熒光團(tuán)的準(zhǔn)確光譜。一旦確定各個(gè)熒光團(tuán)中的光譜作用，所采集的疊合圖像就可以被分離成各個(gè)熒光團(tuán)的獨(dú)立圖像。

每個(gè)“分離”圖像都由來(lái)自單獨(dú)“通道”的重疊圖像組成（以上述 Alexa 680 和 Alexa 700 為例）。各個(gè)圖像都可以在布魯克MI軟件中打開(kāi)，并使用感興趣區(qū)（ROI）應(yīng)用的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，例如，平均值、總和和凈光強(qiáng)度、面積和周長(zhǎng)以及自動(dòng)ROI查找功能和圖像數(shù)學(xué)。換句話說(shuō)，相機(jī)測(cè)量的強(qiáng)度可能與動(dòng)物體內(nèi)發(fā)光物質(zhì)釋放的“真實(shí)”信號(hào)強(qiáng)度以復(fù)雜方式有相關(guān)性。傳感器捕捉到信號(hào)之后，接下來(lái)的多光譜分析可以定量產(chǎn)生準(zhǔn)確的成分特定數(shù)據(jù)（1）.

使用綠色或紅色基因熒光報(bào)告或乃至多個(gè) NIR 熒光團(tuán)的研究可以受益于熒光光譜建模。使用多光譜成像可以識(shí)別和建模報(bào)告基因的不同光譜曲線，從而減少自體熒光。圖 9 和 10 顯示了采用多光譜方法扣除組織自體熒光的感染利什曼原蟲(chóng)的兔足墊模型成像（M. Leevy，美國(guó)圣母大學(xué)，未出版）。

在另一個(gè)例子中，多光譜成像被用于一項(xiàng)體內(nèi)聚合物粒子示蹤研究（5）。注射 4 小時(shí)后，在肝臟區(qū)域（圖 11）檢測(cè)到標(biāo)記為Cy7 的顆粒，在 GI 區(qū)域獲得的可能由食物葉綠素產(chǎn)生的串?dāng)_信號(hào)被分離，提供了顆粒信號(hào)的清晰定位。

在一項(xiàng)納米顆粒/腫瘤研究中，在同一腫瘤小鼠中檢測(cè)到了不同大小的納米顆粒生物分布（6）。納米顆粒被差異標(biāo)記，多光譜成像也用于分離循環(huán)納米顆粒的信號(hào)（圖 12）。

釋放體內(nèi)熒光成像的所有潛能

總結(jié)

活體多光譜熒光成像可以扣除組織自體熒光和進(jìn)行多種熒光團(tuán)成像。這可以增強(qiáng)信噪比并進(jìn)行先進(jìn)的多重?zé)晒獬上�，�?shí)現(xiàn)更強(qiáng)大的研究設(shè)計(jì)。

參考文獻(xiàn)

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translocation and in vivo analysis of polymeric micro-doughnuts. Chem Commun (Camb). 14;( 30 ):3507-9

[6] Chou LY, Chan WC (2012). Fluorescence-tagged gold nanoparticles for rapidly characterizing the size-dependent biodistribution in tumor models. Unpublished.