前言

在研究中經(jīng)常會(huì)涉及DNA或染色體的損傷，因?yàn)镈NA損傷與很多疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系，如遺傳疾病、腫瘤等。放射性輻射、環(huán)境影響或化合藥物等都有可能引起DNA的損傷。之前的研究表明標(biāo)記組蛋白H2AX在絲氨酸139上的磷酸化位點(diǎn)是敏感的可早期預(yù)測(cè)DNA雙鏈斷裂的方法。本文詳細(xì)介紹了自動(dòng)細(xì)胞成像檢測(cè)DNA損傷的實(shí)驗(yàn)方法，細(xì)胞樣品由小分子化合物處理，經(jīng)過(guò)磷酸化組蛋白H2AX免疫熒光染色后成像。另外，實(shí)驗(yàn)中選用了三種細(xì)胞系，CHO、Hela和PC-12，分別加入絲裂霉素和依托泊苷進(jìn)行處理來(lái)檢測(cè)化合物對(duì)其的影響。

磷酸化H2AX免疫熒光方法定量DNA損傷

細(xì)胞水平的DNA損傷可應(yīng)用商業(yè)化的試劑和ImageXpress^® Nano自動(dòng)成像與分析系統(tǒng)可視且定量。免疫熒光法用的是抗磷酸化H2AX(EMD Millipore)的一抗和AlexaFluor標(biāo)記的二抗(Life Technologies)。Hoechst33342染核，由ImageXpress Nano獲取圖像，10X物鏡，DAPI和FITC通道。

- 在平底透明384孔板中種入細(xì)胞，5,000-7,500細(xì)胞/孔
- 在37°C/5%CO2環(huán)境下放置細(xì)胞過(guò)夜
- 按1:2系列梯度DNA毒性化合物加入孔中，處理細(xì)胞18-24小時(shí)
- 室溫下用4%多聚甲醛固定細(xì)胞
- PBS洗去固定液，然后加入1%BSA+0.1%TritonX-100對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉并打孔，室溫孵育30分鐘
- 加入抗H2AX一抗4℃孵育過(guò)夜
- 1XPBS洗3次
- 加入熒光二抗和16μMHoechst室溫孵育1-2小時(shí)
- 1XPBS洗3次
- 用ImageXpressNano系統(tǒng)10X物鏡下獲取圖像，并運(yùn)行CellScoring模塊實(shí)時(shí)定量

優(yōu)勢(shì)

- 細(xì)胞固定后用免疫法對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行熒光染色，并成像
- 精確計(jì)算DNA雙鏈斷裂位點(diǎn)
- On-the-fly分析可實(shí)時(shí)得出計(jì)算結(jié)果
- 通過(guò)熱圖顯示陽(yáng)性孔

Cell Scoring模塊實(shí)時(shí)高效定量DNA損傷DNA損傷

CellReporterXpress^TM自動(dòng)圖像獲取與分析軟件包括了預(yù)置的Cell Scoring模塊，它可以輕松根據(jù)DNA損傷標(biāo)記設(shè)定損傷陽(yáng)性和陰性分類，并計(jì)算出產(chǎn)生DNA損傷的細(xì)胞百分比。圖像獲取和分析通常是一起運(yùn)行的，孔板讀取完就可以同時(shí)看到圖像和分析得到的數(shù)據(jù)。另外，由于檢測(cè)器的大靶面特性，10X物鏡下一個(gè)視野的細(xì)胞足夠定量得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的濃度效應(yīng)曲線數(shù)據(jù)了(圖2)。其次，在此拍攝條件下，一個(gè)視野可拍攝>500個(gè)細(xì)胞(絲裂霉素C最高濃度)和>2800個(gè)細(xì)胞(低毒性濃度的絲裂霉素C)。

參考文獻(xiàn)

1. Paull T.T., Rogakou E.P., Yamazaki V.,Kirchgessner C.U., Gellert M., BonnerW.M..2000. A critical role for histone H2AXin recruitment of repair factors to nuclearfoci after DNA damage. Curr Biol. 10,