施松濤教授任職于賓夕法尼亞大學(xué)，長期從事口腔再生醫(yī)學(xué)及其臨床轉(zhuǎn)化方面的研究工作。近期其研究團隊利用Arraystar DNA甲基化芯片研究移植間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）通過表觀遺傳調(diào)控Notch信號改善紅斑狼瘡患者的骨質(zhì)疏松。這一重要研究發(fā)現(xiàn)發(fā)布在Cell Metabolism雜志（IF：17.565）上（DNA甲基化芯片實驗由康成生物提供技術(shù)服務(wù)） 。

研究背景
    近年來，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者低骨密度和脆性骨折的發(fā)病率逐年增加。目前廣泛認(rèn)為系統(tǒng)性紅斑狼瘡可以增加骨折的風(fēng)險，并且大量臨床研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者易發(fā)生骨質(zhì)疏松。而具有自我更新并分化成多種細(xì)胞類型能力的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植（BSCT）能夠有效增加局部骨量，提高骨密度，改善局部骨質(zhì)疏松情況，糾正骨代謝失衡，減少骨量丟失，增加成骨，為局部骨質(zhì)疏松的治療提供了一種新方法。但是對間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療改善骨質(zhì)疏松的分子機制仍不清楚。DNA甲基化是機體通過表觀遺傳機制調(diào)控基因表達的重要方式，許多研究證明DNA甲基化可以參與多種信號通路，在成骨和骨質(zhì)疏松發(fā)展進程中發(fā)揮重要功能。本次研究目的在于探究移植間充質(zhì)干細(xì)胞對于改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡引發(fā)的骨質(zhì)疏松的表觀機制，尤其是DNA甲基化的調(diào)控作用，為干細(xì)胞移植治療提供理論依據(jù)。

 

研究思路
    在本課題中，研究人員采用正常小鼠、MRL/lpr小鼠（系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型）和用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植（MSCT）治療的小鼠作為實驗材料，分別采用DNA甲基化芯片和microRNA芯片對3個樣本的基因啟動子甲基化水平和microRNA表達譜進行分析。發(fā)現(xiàn)Notch信號通路相關(guān)基因啟動子區(qū)域在疾病組中呈現(xiàn)低甲基化，相應(yīng)蛋白水平升高。而疾病組中microRNA29b表達明顯上調(diào)，結(jié)合以往研究背景，研究人員鎖定DNMT1為microRNA靶基因。進一步機制研究表明，疾病組中microRNA表達升高是因為缺乏Fas蛋白，F(xiàn)as缺乏會引起miR-29b無法釋放，因而提高了細(xì)胞內(nèi)miR-29b的水平，并會在MRL/lpr BMMSCs中下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（Dnmt1）的表達。這會導(dǎo)致Notch1啟動子的低甲基化并激活Notch信號通路，轉(zhuǎn)而損害了成骨細(xì)胞分化。不僅如此，實驗還發(fā)現(xiàn)，由MSCT分泌的外泌體，會轉(zhuǎn)移Fas到受體MRL/lpr BMMSCs中，降低細(xì)胞內(nèi)miR-29b的水平，這會恢復(fù)Dnmt1介導(dǎo)的Notch1啟動子的甲基化，從而改善MRL/lpr BMMSC的功能。
     
技術(shù)路線

圖1：左圖為正常小鼠MSC成骨分化結(jié)果，紅色染色區(qū)域為形成的新骨；中圖為骨質(zhì)疏松小鼠MSC成骨分化結(jié)果，其紅色染色區(qū)域面積明顯低于左圖，表明成骨分化能力較弱；右圖為骨質(zhì)疏松小鼠接受正常MSC治療后，其MSC成骨分化能力已經(jīng)恢復(fù)正常水平，與左圖相似。

 

圖2：將綠色熒光標(biāo)記的外泌體靜脈注射到疾病小鼠體內(nèi)24小時后，對小鼠骨髓細(xì)胞檢測觀察，發(fā)現(xiàn)外泌體可被疾病小鼠骨髓細(xì)胞吸收。紅色為細(xì)胞膜，綠色為吸收入細(xì)胞內(nèi)的外泌體，藍色為細(xì)胞核。

 

圖3：MA分析DNA甲基化芯片檢測結(jié)果顯示與正常C3H/HeJ小鼠相比，MRL/lpr系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病組小鼠整體啟動子區(qū)甲基化下降，經(jīng)過間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療后，甲基化水平有顯著回升。