2017年國自然申請的熱點(diǎn)什么？circRNA，lncRNA，外泌體。除了這些大家耳熟能詳?shù)南沭x饃之外，現(xiàn)在很多小伙伴們開始了新的玩法，通過多平臺聯(lián)用，將不同層面的東西結(jié)合起來，比如，表觀遺傳與非編碼RNA的結(jié)合，就是一個(gè)很好的例證。

研究背景

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，特別在中國，由于環(huán)境的污染，肺癌的發(fā)生率也在持續(xù)升高。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常見的一種，大約占了肺癌總量的85%，但是，目前我們對于NSCLC的理解還是處于初級階段。其中，表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究為我們理解腫瘤的發(fā)生提供了很多的證據(jù)。那么，這兩個(gè)層面的分子又存在什么樣的關(guān)聯(lián)呢？本研究從甲基化，lncRNA和基因表達(dá)調(diào)控的角度出發(fā)，為我們理解NSCLC的發(fā)生和臨床診斷提供了新的靶標(biāo)。

研究思路

研究結(jié)果

1． 鑒定NSCLC特異性lncRNA-mRNA

NSCLC在轉(zhuǎn)錄組層面，有哪些特異性表達(dá)的分子呢？利用轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜芯片（SBC human lncRNA array伯豪生物提供），研究人員發(fā)現(xiàn)有8500個(gè)lncRNA和1685個(gè)mRNA在癌和癌旁中有顯著差異。通過對這些差異基因分析相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)有1345個(gè)lncRNA與mRNA存在cis關(guān)系，159個(gè)lncRNA與mRNA有trans關(guān)系。把這些與lncRNA關(guān)聯(lián)的cis mRNA進(jìn)行IPA功能（IPA分析，詳情咨詢shbio）分析發(fā)現(xiàn)，主要的pathway涉及到腫瘤相關(guān)，包括細(xì)胞死亡與生存，細(xì)胞發(fā)育，細(xì)胞生長和增殖，表明這些關(guān)聯(lián)的lncRNA可能參與腫瘤發(fā)生過程。研究人員把其中的兩個(gè)lncRNA與mRNA(LOC146880/KPNA2，ENST00000439577/RCC2)作為后期驗(yàn)證的重點(diǎn)。

2. lncRNA與甲基化關(guān)聯(lián)分析

除了轉(zhuǎn)錄組層面的變化，表觀遺傳層面會有什么差異呢？利用甲基化芯片，研究人員發(fā)現(xiàn)癌和癌旁共有113644個(gè)差異CpG位點(diǎn)。其中，cg12562461位點(diǎn)正好位于LOC146880的啟動(dòng)子區(qū)，且在癌組織中甲基化程度低。因此，cg12562461的低甲基化正好與LOC146880的高表達(dá)相對應(yīng)。

3.lncRNA/mRNA與臨床指標(biāo)關(guān)聯(lián)性分析

通過qPCR，研究人員首先在大量樣本中（402個(gè)癌組織，105個(gè)癌旁組織）進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)LOC146880和KPNA2在癌中高表達(dá)，且兩者表達(dá)顯著相關(guān)。進(jìn)一步分析LOC146880和ENST00000439577與病人臨床指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)LOC146880與病理類型和腫瘤大小有關(guān)，ENST00000439577的表達(dá)與轉(zhuǎn)移狀態(tài)和疾病stage有關(guān)。Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示，training組和validation組中，高的LOC146880伴隨著低的總生存期。同時(shí)，在126個(gè)癌組織和30個(gè)癌旁中，cg12562461的甲基化程度也明顯低于癌旁。同樣，ENST00000439577和RCC2的表達(dá)也是在癌組織中高，兩者表達(dá)正相關(guān)。高的ENST00000439577表達(dá)也與低總生存期相關(guān)。因此，這兩個(gè)lncRNA可以作為潛在的診斷指標(biāo)。

4.lncRNA細(xì)胞系功能驗(yàn)證

為驗(yàn)證在肺癌中LOC146880的生物學(xué)功能，研究人員分別檢測了三個(gè)NSCLC細(xì)胞系（A549，PC9，H1299）和正常細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)LOC146880在A549和PC9中表達(dá)高。當(dāng)在這兩個(gè)細(xì)胞系中siRNA- LOC146880敲降，發(fā)現(xiàn)KPNA2的表達(dá)也隨之降低。此外，細(xì)胞增殖，遷移和侵襲受到抑制，細(xì)胞周期過程減慢了G2/M phase。因此，這些結(jié)果都表明LOC146880可能是NSCLC的致癌因子。

基于TRANSFAC預(yù)測，研究人員發(fā)現(xiàn)LOC146880的CpG位點(diǎn)區(qū)有轉(zhuǎn)錄因子SP1的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)將LOC146880的啟動(dòng)子區(qū)載體構(gòu)建（pGL3- LOC146880），和SP1過表達(dá)載體同時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T，A549，H1299時(shí)，發(fā)現(xiàn)pGL3- LOC146880顯著激活。因此，SP1確實(shí)能結(jié)合到LOC146880啟動(dòng)子區(qū)，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響其表達(dá)。

在NSCLC三個(gè)細(xì)胞系（A549，H1975，H1299）和正常細(xì)胞系檢測ENST00000439577表達(dá)，發(fā)現(xiàn)比正常細(xì)胞系中都高。當(dāng)在A549，H1299中siRNA干擾后，RCC2表達(dá)也降低，細(xì)胞增殖，遷移和侵襲也降低，細(xì)胞在G2/M phase稍微降低。因此，ENST00000439577可能也是肺癌的一個(gè)致癌因子。

研究結(jié)論

該研究通過將表達(dá)譜芯片與甲基化芯片結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，找到了啟動(dòng)子區(qū)甲基化降低，同時(shí)基因表達(dá)升高的lncRNA，并發(fā)現(xiàn)他們的表達(dá)與cis靶基因KPNA2和RCC2的表達(dá)正相關(guān)，并與低生存期相關(guān)。細(xì)胞系的siRNA干擾，功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，這兩個(gè)lncRNA抑制了細(xì)胞增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移。該研究同時(shí)將表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄關(guān)聯(lián)起來，從更全面的角度去理解了lncRNA在非小細(xì)胞肺癌中的作用。這種平臺聯(lián)用的方式是該研究的亮點(diǎn)，也是現(xiàn)在最新的流行趨勢，非常值得借鑒。

原文出處：Feng N, Ching T, Wang Y，et al. Analysis of Microarray Data on Gene Expression and Methylation to Identify Long Non-coding RNAsin Non-small Cell Lung Cancer. Sci Rep.2016.