上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院房靜遠(yuǎn)教授主要從事消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制、早期診斷和分子治療等相關(guān)研究。近期，該課題組應(yīng)用美國Arraystar公司的lncRNA芯片分析了胃癌組織的lncRNAs表達(dá)情況，篩選到可預(yù)測胃癌發(fā)生的分子標(biāo)志物GClnc1，并且闡明了GClnc1在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中是如何發(fā)揮調(diào)控作用的。該研究成果于2016年發(fā)表在國際著名學(xué)術(shù)期刊Cancer Discovery(影響因子19.783)上。（芯片實驗由康成生物提供技術(shù)服務(wù)）

研究背景

胃癌（GC）是一種常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在癌癥患者中位列第四。由于早期缺乏特異性癥狀，大多數(shù)患者被診斷時已經(jīng)處于胃癌晚期。晚期胃癌患者的預(yù)后較差，并最終死于術(shù)后的癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。近幾年，科學(xué)家一直致力于尋找用于檢測早期胃癌或者可以反映個體患癌風(fēng)險較高的生物標(biāo)志物，但是收效甚微。非編碼RNAs是一類長度在200nt以上的長鏈非編碼RNA，研究表明lncRNA的異常表達(dá)和癌癥的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系，比如HOTAIR、MALAT1和H19等在癌癥的發(fā)生中都扮演著重要的角色。前期已有文獻(xiàn)報道lcnRNA在胃癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，但是其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的探究。

本文的研究目的就是借助lncRNA芯片來篩選可以用于檢測胃癌的生物標(biāo)志物，并通過大量的功能實驗來驗證異常表達(dá)的lncRNA是如何調(diào)控胃癌相關(guān)的信號通路。

研究思路

作者首先檢測了10個胃癌病人的胃癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA的表達(dá)情況（Arraystar human lncRNA v2.0），借助比較嚴(yán)格的篩選條件（原始信號值>1500, Foldchange>2以及P-value<0.01）找到了8個在胃癌組織中表達(dá)顯著增加的候選lncRNAs。接著擴(kuò)大樣本進(jìn)行RT-PCR驗證，從而鎖定了其中的4個lncRNAs進(jìn)行后續(xù)的研究。

接下來，作者對這4個lncRNAs做了臨床分析（KM和ROC曲線），發(fā)現(xiàn)只有l(wèi)ncRNA BC041951的異常表達(dá)和胃癌是顯著相關(guān)，并且BC041951的表達(dá)量從正常胃組織到胃癌的四個階段是逐漸增加。因此，推測lncRNA BC041951可以作為預(yù)測胃癌發(fā)生的生物標(biāo)志物，并進(jìn)行后續(xù)的功能和機(jī)制研究，同時將lncRNA BC041951命名為GClnc1。

為了進(jìn)一步探究GClnc1和胃癌的關(guān)系，作者做了一系列的生物信息學(xué)分析以及功能性實驗。作者先將GClnc1敲除，然后借助RNA-seq來篩選GClnc1可能調(diào)控的基因。通過RNA-seq找到異常表達(dá)的基因后進(jìn)行基因集富集分析（GSEA），發(fā)現(xiàn)GClnc1調(diào)控的基因中大部分都是癌相關(guān)基因，比如c-MYC和CDK1等。同時，功能性實驗也證明GClnc1可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和入侵，最后促進(jìn)胃癌的發(fā)生。

lncRNAs可以通過和轉(zhuǎn)錄因子或者其他細(xì)胞因子結(jié)合來發(fā)揮功能。為了探究GClnc1具體的作用機(jī)制，作者利用RNA pull down實驗和質(zhì)譜來尋找GClnc1可能結(jié)合的蛋白。通過質(zhì)譜實驗，作者鑒定了近200個蛋白，同時選取了其中的10個和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的蛋白進(jìn)行WB驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有蛋白WDR5和KAT2A可以和GClnc1特異性結(jié)合，其中WDR5是H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶，而KAT2A是H3K9乙酰轉(zhuǎn)移酶。接下來，作者利用siRNA和RIP實驗進(jìn)一步證明了GClnc1可以特異性和蛋白WDR5以及KAT2A結(jié)合形成復(fù)合物。

為了驗證GClnc1是否可以調(diào)控蛋白WDR5和KAT2A在全基因組的結(jié)合位點，作者借助ChIP-seq和RNA-seq實驗做了進(jìn)一步的驗證（GClnc1 shRNA VS control shRNA）。結(jié)果表明，GClnc1敲低后會導(dǎo)致蛋白WDR5和KAT2A在全基因組上的結(jié)合能力下降，進(jìn)而使得相應(yīng)基因的表達(dá)水平也會受到抑制。因此，作者推測GClnc1做為WDR5和KAT2A形成復(fù)合物的支架來調(diào)控兩個蛋白對于組蛋白的修飾能力，進(jìn)一步調(diào)控基因的表達(dá)和生物學(xué)功能。

根據(jù)ChIP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶SOD2是WDR5和KAT2A復(fù)合物的一個靶基因，并且根據(jù)CNC分析發(fā)現(xiàn)SOD2和GClnc1之間也具有高度相關(guān)性（正相關(guān)）。作者分析了GClnc1和SOD2在基因組上的位置關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GClnc1的部分序列和SOD2的3’端的最后一個外顯子重疊，并且經(jīng)過生信分析發(fā)現(xiàn)兩者之間不存在共同的miRNA結(jié)合位點。作者接著做了一系列的功能實驗（GOF/LOF）來驗證GClnc1以及SOD2的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)GClnc1確實可以通過調(diào)控SOD2來促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展。作者接下來的目的就是研究GClnc1是如何調(diào)控SOD2來發(fā)揮生物學(xué)功能的。

作者推測H3K4me和H3K9A可能調(diào)控基因SOD2的轉(zhuǎn)錄。RT-PCR和Westernblot實驗也表明敲低WDR5或KAT2A可以減弱由GClnc1誘導(dǎo)的SOD2表達(dá)水平的上調(diào)。這就表明WDR5、KAT2A和GClnc1可能共同調(diào)控SOD2的表達(dá)（通過調(diào)控SOD2啟動子組蛋白修飾）。接下來作者就對此進(jìn)行了驗證，ChIP實驗表明WDR5和KAT2A可以直接結(jié)合在SOD2的啟動子區(qū)域，并且發(fā)現(xiàn)敲低WDR5、KAT2A或GClnc1都會顯著降低另外一種蛋白在SOD2上的結(jié)合能力，說明GClnc1在調(diào)控WDR5/KAT2A和SOD2啟動子區(qū)域的結(jié)合過程中扮演著重要角色。作者進(jìn)一步證明在SOD2啟動子區(qū)域存在H3K4me3和H3K9Ac，并且改變GClnc1的表達(dá)水平，H3K4me3和H3K9Ac的豐度也會發(fā)生變化。ChIRP分析顯示GClnc1直接結(jié)合在SOD2的啟動子區(qū)域。

上述研究表明GClnc1可以做為一個支架把組蛋白修飾酶WDR5和KAT2A招募至SOD2的啟動子處，從而激活該基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展。

技術(shù)路線

結(jié)果展示

圖1. RT-PCR驗證及臨床分析

圖2. 受GClnc1調(diào)控的基因做GSEA分析

圖3. RNA pull down-MS分析和Westblot驗證
 

圖4. CNC分析及驗證

研究意義

本研究借助美國Arraystar公司的human lncRNA array在胃癌中篩選到大量異常表達(dá)的lncRNA，臨床分析發(fā)現(xiàn)lncRNA GClnc1可以做為預(yù)測胃癌發(fā)生的生物標(biāo)志物。接著，作者還做了大量的生信分析和功能實驗來探究GClnc1是如何促進(jìn)胃癌發(fā)生和發(fā)展的�？傊�，GClnc1可以做為治療胃癌的一個潛在靶點；并且本研究的芯片數(shù)據(jù)對胃癌的診斷和治療，以及探究非編碼RNA的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。


原文出處
A novel lncRNA GClnc1 promotes gastric carcinogenesis and may act as a modular scaffold of WDR5 and KAT2A complexes to specify the histone modification pattern. Cancer Discovery. 2016.