1.  放射性標(biāo)記的磷酸化蛋白質(zhì)在SDS-聚凝膠上進(jìn)行制備電泳。電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用水洗膜數(shù)次，不要讓膜變干。 

2.  用30~50 ml 印度墨汁染色液染膜5~10 min，輕搖至條帶出現(xiàn)。也可在作好放射性或磷光位置標(biāo)記后，用塑料膜包住膜，進(jìn)行放射性自顯影。 

3.  用干凈刀片切下含目的條帶的膜，用甲醇將膜重新潤濕1 min，再用多于0.5 ml 水的潤濕。置于帶螺口蓋的微量離心管。

4.  加入足夠量的6 mol/l HCl，淹沒膜，擰緊管蓋，在110℃烤箱溫育60 min。

5.  自然冷卻，高速離心2 min，將液相的水解物移至一個新的微離心管中，真空干燥2 h。

 

6.  加入6~10 μl 水，在旋渦混合器上劇烈振蕩以溶解樣品，高速離心5 min。

7.  取25%~50%的樣品點(diǎn)樣于20 cm×20 cm×100 μm 纖維素薄層色譜板的樣品孔。分小份點(diǎn)樣，毎次點(diǎn)加0.25~0.5 μl，在每次點(diǎn)加之間，用通過塞有棉花的巴斯德吸管所送出的壓縮空氣吹干加樣點(diǎn)。

8.  取1 μl 非放射性的磷酸氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合物（含磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸和磷酸酪氨酸）點(diǎn)在每個樣品之上，如上分次點(diǎn)加，每次0.25~0.5 μl。

9.  在大的玻璃托盤或塑料盒內(nèi)，用pH1.9電泳緩沖液浸濕大的吸水紙（帶4個孔），緩緩倒干多余的緩沖液。將此大吸水紙轉(zhuǎn)移覆蓋在已加樣的薄層色譜板上，使得色譜板上的4個加樣點(diǎn)位干大吸水紙的四個洞的中央，輕壓吸水紙以潤濕纖錐素和樣品，當(dāng)色譜板均勻潤濕后，移去吸水紙。

10.  將薄層色譜板置于電泳裝置內(nèi)，在板的左右兩倆0.5 cm 邊緣用Whatman 3MM 紙搭接，如果有氣泡，將其弄平排出。蓋上蓋子，開始電泳。在HTLE 7 000電泳儀用雙層厚的Whatman 3MM 紙搭接時，載4個樣品的薄層板在1.5 KV 電泳20 min。
 

圖1 磷酸氨基酸在pH1.9進(jìn)行第一向電泳分離
 

11.  電泳后，取出薄層板，用電吹風(fēng)快速吹干20 min（無須加熱）。

12.  用pH3.5電泳緩沖液湲濕小的吸水紙，并如步驟10所述以之去均勻潤濕薄層色譜板，注意避免將吸水紙放在樣品之上。