摘要:目的 　探討不同劑量維生素E(Vitamin E , Vit E) 對慢性間斷性缺氧(chronic episodic hypoxia , EHYP) 大鼠學習記憶能力和腦內(nèi)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase , ChAT) 活性的影響。方法 　建立EHYP大鼠模型,并給予大(50IUP250g體重Pd) 、小(5IUP250g體重Pd) 劑量Vit E干預。用被動避暗回避反射試驗評價大鼠學習記憶能力,潛伏期(STL) 越長,學習記憶能力越強;用放射化學法測定大鼠皮層、海馬和紋狀體ChAT活性。結(jié)果 　EHYP處理后,與對照組相比, EHYP 組大鼠STL明顯縮短( P< 0. 01) ,各腦區(qū)ChAT活性均顯著降低( P < 0. 05) 。藥物干預后,與EHYP組相比,Vit E大、小劑量組大鼠STL均顯著延長(Vit E大劑量組: P< 0. 05 ,Vit E小劑量組: P < 0. 01) ,但大劑量組大鼠STL明顯短于小劑量組( P < 0. 05) ;就ChAT活性而言,小劑量組大鼠各腦區(qū)ChAT活性均顯著升高( P < 0. 05) ,而大劑量組大鼠僅海馬和紋狀體ChAT活性顯著升高( P < 0. 05) 。結(jié)論 　Vit E可改善EHYP大鼠學習記憶能力并提高其腦內(nèi)ChAT活性,且小劑量優(yōu)于大劑量。

關(guān)鍵詞:缺氧;被動避暗回避反射試驗;膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶;維生素E

　　阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep ap2nea syndrome , OSAS)可引起學習記憶障礙已成為不爭的事實,大量研究顯示,慢性間斷性缺氧(chronic epi2

sodic hypoxia , EHYP)在其中發(fā)揮了重要作用。目前,有關(guān)OSAS的治療方法較多,但至今尚未找到有效方法預防和改善OSAS所致的學習記憶障礙。維生素E(Vitamin E , Vit E)是一種脂溶性維生素,有文獻報道它通過其抗氧化特性可改善AD及衰老所致的認知障

礙。我們通過建立能反映OSAS部分特征(即:慢性間斷性缺氧)的EHYP大鼠模型,觀察Vit E對EHYP大鼠學習記憶及腦內(nèi)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltrans2ferase , ChAT)活性的影響,為尋找改善OSAS患者學習記憶障礙的方法提供實驗依據(jù)。

材料和方法

一、材料

Vit E(T3634 , 1000 IUPg , Sigma公司。用大豆油稀釋,配成50 IUPml和5 IUPml兩種濃度。) , 3H2乙酰CoA(185CiPmmol , Amersham Life Science公司) ,常壓低氧艙

(中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院肺心病研究室) ,O2 、CO2 濃度測定儀(上海嘉定學聯(lián)儀表廠) ,程控避暗箱(中國醫(yī)學科學院藥物所) ,液閃儀(西安262廠) 。

二、方法

1.實驗動物和分組:雄性SD大鼠40只, 190～200g ,購自北京協(xié)和醫(yī)院動物中心,經(jīng)被動避暗回避反射試驗初篩后,將符合條件的34只大鼠隨機分為對照組( n = 7) 、EHYP組( n = 9) 、Vit E大劑量組( n = 9)和Vit E小劑量組( n = 9) 。經(jīng)35天EHYP處理后死亡7只,最終各實驗組大鼠數(shù)目為:對照組7只, EHYP 組7只,Vit E大劑量組6只,Vit E 小劑量組7只。各實驗組大鼠缺氧前體重、缺氧后體重和增加體重無顯著性差異( P> 0. 05) 。

2.動物模型的建立: (1) EHYP組參照薛全福等制作EHYP大鼠模型。將大鼠置于常壓低氧艙內(nèi),向艙內(nèi)注入氮氣,同時在艙內(nèi)放大量堿石灰和硅膠以吸收CO2 和水蒸氣,使艙內(nèi)氧濃度持續(xù)控制在10 ±0. 5% ,CO2 濃度始終< 3 % ,濕度為50±10 %。艙壁有小縫隙與艙外相通,使艙內(nèi)氣壓與大氣壓平衡。每次缺氧時氧濃度從23 %降至10 %的時間為45分鐘。缺氧期間,大鼠攝食、飲水同常。缺氧前30min用直接灌胃法予1ml大豆油。每天缺氧8h ,連續(xù)缺氧35天后結(jié)束。(2)對照組除不行缺氧處理外,余條件同EHYP組。(3)Vit E大、小劑量組 缺氧前30min用直接灌胃法予1ml大(50 IUPml) 、小(5 IUPml)劑量Vit E代替大豆油,余處理同EHYP組。3.學習記憶的測定:參照Ando等用被動避暗回避反射試驗測定大鼠學習記憶能力。檢測步驟如下:(1)初篩期缺氧處理前,將大鼠背對洞口放入明室,啟動計時器,90s 內(nèi)進入暗室的大鼠作本實驗用。(2)訓練期 缺氧處理后,大鼠背對洞口放入明室,進入暗室后,通電刺激2s ,電激后5s取出大鼠,歸回飼養(yǎng)籠。(3)測定期 訓練后24小時,再將大鼠背對洞口置于明室,同時開啟計時器,記錄大鼠第一次進入暗室時間,為潛伏期(STL) ,觀察5min ,始終未進入的大鼠STL規(guī)定為300s。

4.取材:行為實驗后,大鼠斷頭處死,全腦取出置于冰盤上,依次取出皮層、海馬和紋狀體,去除腦膜和血管,迅速稱重后置于液氮保存。為避免ChAT活性的周期性節(jié)律變化,各實驗組大鼠均于9Am左右處死,且交替斷頭取材。

5. ChAT活性的測定:參照Fonnum的方法。將待測腦組織按1 : 20(WPV)加入10mmolPL EDTA的PB緩沖液(0. 05M , PH = 7. 4) 。用超速勻漿器制備勻漿液,取40ul至一空白試管,同時加入40ul反應液和20ul 3H2乙酰CoA ,于37度孵育30min。用反應終止液終止反應。將孵育液移入閃爍杯,加2ml四苯硼鈉2乙腈溶液和10ml甲苯閃爍液,輕搖1min ,使生成的3H2乙酰膽堿提取到甲苯相(未利用3H2乙酰CoA則留在水相) 。靜置10min后于液閃儀測定每分鐘衰變率(Decay Per Minute , DPM)值。結(jié)合勻漿液的蛋白量,計算出ChAT活性,以pmol·mg蛋白·min表示。6.蛋白的測定:參照Lowry等方法,用考馬斯亮藍G2250與蛋白質(zhì)相互作用后的吸光度值測定樣品中的蛋白濃度。用牛血清蛋白作為標準蛋白。

7.統(tǒng)計學處理:所有數(shù)據(jù)用均數(shù) ±標準差表示,多個樣本間計量資料的比較用方差分析及Q檢驗作顯著性檢驗,多個樣本間非參數(shù)資料的比較用Nemenyi法作顯著性檢驗,檢驗顯著水平為P< 0. 05。