C-肽ELISA試劑盒使用說明

 （德國(guó)DRG：EIA-1293）

1、DRG公司C-肽ELISA試劑盒的臨床應(yīng)用

1）  接受了胰島素治療的糖尿病患者剩余β-細(xì)胞的功能評(píng)價(jià)。

2）  I型糖尿病患者緩解階段的檢測(cè)與監(jiān)控。

3）  作為I型糖尿病（胰島素依賴性）和II型糖尿�。ǚ且葝u素依賴性）鑒別診斷的輔助工具。

4）  胰島素引起的假低血糖癥的診斷。

5）  輔助胰島素瘤的診斷。（胰島素抑制實(shí)驗(yàn)）

6）  用于檢測(cè)糖尿病孕婦妊娠成功的預(yù)后指數(shù)。

7）  肝病患者胰島素分泌的評(píng)價(jià)。

8）  胰腺切除術(shù)的監(jiān)測(cè)。

2、實(shí)驗(yàn)原理

DRG公司C-肽ELISA試劑盒是以競(jìng)爭(zhēng)原理為基礎(chǔ)。樣品中存在的未知含量的C-肽和已知濃度的C-肽酶聯(lián)結(jié)物相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到小鼠抗C-肽抗血清的結(jié)合位點(diǎn)。再與包被在檢測(cè)孔上的抗小鼠抗體結(jié)合。沒有結(jié)合的酶復(fù)合物被沖洗下來。加入底物溶液后，樣本中的 C-肽濃度和測(cè)得的光密度成反比例。

3、試劑盒組成

1)       微孔反應(yīng)板，96（孔），包被孔中包被了抗小鼠抗體。

2)       酶聯(lián)結(jié)物，14ml。即用型，內(nèi)含C-肽生物素標(biāo)記物和穩(wěn)定緩沖液。

3)       酶復(fù)合物，14ml，即用型，內(nèi)含辣根過氧化物酶

4)       標(biāo)準(zhǔn)品系列（0-5），0-16ng/ml(具體濃度請(qǐng)見試劑瓶標(biāo)簽)。凍干粉，6支，用前加蒸餾水0.75mL。

5)       樣品稀釋液，3ml，即用型。

6)       抗血清：小鼠抗C-肽單克隆抗體，1支，7mL。

7)       底物液，TMB，14ml

8)       終止液，0.5M的H₂SO₄，14ml。

9)       濃縮冼滌液，40倍濃縮，30ml。

4、實(shí)驗(yàn)所需器材但試劑盒不提供

1）  酶標(biāo)儀

2）  移液器，100；200和1000μl

3）  標(biāo)準(zhǔn)冰箱

4）  吸水紙

5）  去離子水

5、貯存條件

當(dāng)貯存在2‑8℃下，未打開的試劑在有效期內(nèi)均有效。不要使用過期試劑。半標(biāo)準(zhǔn)品配制好后，所有剩余的標(biāo)準(zhǔn)品必須冷藏于2‑8℃的環(huán)境下。要更長(zhǎng)時(shí)間的貯存，可將重新配制好的標(biāo)準(zhǔn)品凍存于-20℃的環(huán)境下。C- 肽生物素聯(lián)結(jié)物、酶復(fù)合物、底物溶液、洗滌液和零標(biāo)準(zhǔn)品必須冷藏于2‑8℃的環(huán)境下。微孔反應(yīng)板也必須冷藏于2‑8℃的環(huán)境下。一旦包裝袋拆開，必須將它重新密封好。

6、樣本的采集和準(zhǔn)備

血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝血，在室溫下離心分離血清。未完全凝血前請(qǐng)勿離心，接受了抗凝劑治療的病人樣品可能需要更長(zhǎng)的凝血時(shí)間。樣本在2~8℃下能存儲(chǔ)24小時(shí)，如果需要儲(chǔ)存更長(zhǎng)時(shí)間則需要在﹣20℃下凍存，并且只能凍融一次

血漿：將全血采集到含有抗凝劑的離心管，采集后立即離心分離。樣本在2~8℃下能存儲(chǔ)24小時(shí)，如果需要儲(chǔ)存更長(zhǎng)時(shí)間則需要在﹣20℃下凍存，并且只能凍融一次

尿液：

1)       24小時(shí)內(nèi)排泄出的尿液總量應(yīng)收集和混合在單獨(dú)的容器中。

2)       記錄下尿液的總體積。

3)       充分混合樣品。離心樣本至澄清，在2~8℃下能儲(chǔ)存36小時(shí)；如果要保存更長(zhǎng)時(shí)間則需要在﹣20℃下凍存，只能凍融一次。

4)       實(shí)驗(yàn)樣本用樣品稀釋液按1：20進(jìn)行稀釋。

7、試劑準(zhǔn)備

標(biāo)準(zhǔn)品：用0.75ml蒸餾水溶解凍干標(biāo)準(zhǔn)品�？梢员３植粍�(dòng)直至完全融化，然后通過輕輕的倒轉(zhuǎn)充分混勻。重新標(biāo)配的標(biāo)準(zhǔn)品在2~8℃能保存3天，如果需要保存更長(zhǎng)時(shí)間則需要放置在﹣20℃下凍存

洗滌液：將30ml的濃縮洗滌液用去離子水1170ml稀釋至1200ml。稀釋后的洗滌液可在室溫下穩(wěn)定存放2周。

8、實(shí)驗(yàn)步驟

1)       將所需數(shù)目的板條置于板架上。

2)       將100μl C—肽標(biāo)準(zhǔn)品，和樣本加到相應(yīng)的檢測(cè)孔中。

3)       各孔中加入50μl抗血清。

4)       各孔中加入100μl酶聯(lián)結(jié)物。

5)       充分振蕩混勻10秒鐘。

6)       室溫溫育60min。

7)       棄去孔內(nèi)反應(yīng)液。

8)       用洗滌液洗板3次（每孔400μl）。末次在吸水紙上拍干反應(yīng)板。

9)       在每微孔中加入100μl酶復(fù)合物。

10)   室溫溫育30分鐘。

11)   棄去孔中的反應(yīng)液。用洗滌液洗板3次（每孔400μl）。末次在吸水紙拍干反應(yīng)板。

12)   以相同的時(shí)間間隔在每一微孔中加入100μl底物液。

13)   室溫靜置20分鐘。

14)   以相同的時(shí)間間隔在每一微孔中加入100μl終止液以終止酶反應(yīng)。

15)   在加完終止液后10分鐘內(nèi)在450±10nm處測(cè)OD值。

9、結(jié)果計(jì)算

可以使用任何一個(gè)能在450±10nm處測(cè)定吸光度值的酶標(biāo)儀。按下述方法可求得每個(gè)樣本血清的C—肽含量值。

1)       在線性或半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上，以每個(gè)參考標(biāo)準(zhǔn)品的平均吸光度值（Y）對(duì)它們相應(yīng)的濃度值（X，ng/ml）做一標(biāo)準(zhǔn)曲線。我們建議您用四參數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2)       利用每個(gè)血清樣本的平均吸光度值，通過從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取相應(yīng)的C-肽值，如有必要，還乘上初始樣本的稀釋倍數(shù)，便可得知它們相應(yīng)的濃度值。利用DRG公司的ELIZAMAT3000和回歸程序可以讀出數(shù)值，并通過使用四參數(shù)邏輯功能或立體回歸得到計(jì)算機(jī)輔助的解釋。

期望值：

血清、尿液中C—肽的正常范圍。

    建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立起自己的正常人C—肽水平范圍。用DRG公司的C—肽酶聯(lián)試劑盒檢測(cè)正常男性和女性所得到的正常范圍值羅列如下：

     此外，用6個(gè)空腹12個(gè)小時(shí)后的正常成人做葡萄糖測(cè)定。在空腹12小時(shí)后，抽取血清。接受測(cè)定的人跟著服用50-60克的葡萄糖，在30-45分鐘后再抽取血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C-肽水平增加了200-600%。

本譯文僅供參考，詳情請(qǐng)以原文為準(zhǔn)。