酶消化法從Wharton膠中分離干細(xì)胞

試劑和材料：
1. 培養(yǎng)基：完全LG-DMEM：含2mmol/L的左旋谷氨酰胺的低糖DMEM，添加10%熱滅活胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素；
2. PBSA；
3. 胰蛋白酶，2.5%；
4. 膠原酶A，0.1%用PBSA配制；
5. 培養(yǎng)瓶；
6. 圓錐形離心管，50ml；
7. 剪刀；
8. 鑷子；

實(shí)驗(yàn)方法：
1. 臍帶取材后，可在PBSA中保存1-24h；
2. 除去血管，將Wharton膠剪成大約0.5cm的小組織塊；
3. 將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)移到50ml離心管，用無血清DMEM洗，室溫250g離心5min；
4. 倒掉上清液，將離心后的沉淀物拍散，浸泡在0.1%膠原酶（大約是沉淀物體積的3倍）中，37℃消化16-18h；
5. 加入適當(dāng)體積的PBSA（消化液體積的2倍），室溫250g離心5min；
6. 倒掉上清液，加2.5%胰蛋白酶（大約是沉淀物體積的2倍）37℃處理30min，輕輕攪動(dòng)；
7. 加入適當(dāng)體積的FBS（消化酶體積的10%）中止胰蛋白酶作用；
8. 用培養(yǎng)基洗；
9. 用培養(yǎng)基重懸分離得到的細(xì)胞，按大約1×103個(gè)細(xì)胞/cm2密度將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中；