實(shí)時熒光定量PCR簡介
熒光定量PCR檢測技術(shù)從誕生到現(xiàn)在已經(jīng)有 8 年了，但是其應(yīng)用在近四年才迅猛增長。在 Medline 數(shù)據(jù)庫中，用“ Taqman” 或 ”real time PCR” 作為關(guān)鍵詞檢索，在1996 年僅有 19 篇，在 1997 年僅有 28 篇，在 98 、 99 、2000 年分別達(dá)到了 52 、 157 、 409 篇， 2003 年已經(jīng)達(dá)到2984 篇，相信在不久的將來會有更多的文章發(fā)表。針對實(shí)時 PCR 這一熱點(diǎn)領(lǐng)域，閃晶公司對它進(jìn)行了深入細(xì)致的研究，并且及時地為廣大科研人員推出這項(xiàng)技術(shù)服務(wù)。 
熒光定量PCR基本原理
• Taqman 技術(shù)：該技術(shù)以美國 ABI 公司為代表。 PCR 擴(kuò)增時，在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個熒光報(bào)告基團(tuán)和一個熒光淬滅基團(tuán)，探針完整時，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收， PCR 儀檢測不到熒光信號； PCR 擴(kuò)增時（在延伸階段）， Taq 酶的 5' － 3' 外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步，這也是定量的基礎(chǔ)所在。 
• Beacon 技術(shù)：該技術(shù)以美國人 Tagyi 為代表。也是加入了熒光探針，但它是 環(huán)狀的寡核苷酸探針，分別由莖部和環(huán)部組成， 兩端分別標(biāo)記 熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光猝滅基團(tuán)，在無靶序列的情況下，探針始終是環(huán)狀，報(bào)告基團(tuán)的熒光被猝滅基團(tuán)猝滅，使熒光檢測儀檢測不到熒光信號；而在有靶序列時，即在 PCR 的退火階段探針與靶序列結(jié)合，使熒光報(bào)告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分開，這樣熒光儀可以檢測到熒光，熒光信號的強(qiáng)弱代表了靶序列的多少。
• FRET 技術(shù)：該技術(shù)以 Roche( 羅氏公司 ) 為代表。它的基本原理是：兩條直線型寡核苷酸探針，其中一條的 3 ‘端標(biāo)記熒光激發(fā)基團(tuán)，另一條的 5 ' 端標(biāo)記熒光檢測基團(tuán)，在無靶序列的情況下，兩條探針分開，無法進(jìn)行能量的傳遞，這樣熒光儀不能檢測到熒光信號；而當(dāng)有靶序列時，即在 PCR 的退火階段兩條探針與靶序列結(jié)合，使得兩條探針上的熒光基團(tuán)可以進(jìn)行能量的傳遞，這樣熒光儀就可以檢測到熒光信號，熒光信號的強(qiáng)弱代表了靶序列的多少。 
• Ct 值：是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如下圖所示）。
• 熒光域值（ threshold ）：是指 PCR 反應(yīng)的前 15 個循環(huán)的熒光信號，熒光域值的缺省設(shè)置是 3-15 個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍，即：threshold。
• Ct 值與起始模板的關(guān)系：研究表明，每個模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系〔 1 〕，起始拷貝數(shù)越多， Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代 Ct 值（如圖 2 所示）。
因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
熒光定量PCR應(yīng)用廣泛
• 可以對各種基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析，如：同一基因在不同組織中的表達(dá)差異、同一基因在不同藥物處理后的表達(dá)差異、轉(zhuǎn)基因食品的檢測。過去最常用的高通量篩選基因表達(dá)差異的技術(shù)是 cDNA 芯片和差異顯示，但這兩種技術(shù)的缺點(diǎn)是只能定性而非完整意義上的定量分析。實(shí)時 PCR 技術(shù)和高通道實(shí)時 PCR 儀的出現(xiàn)，無疑為這種檢測提供了極大的方便。
• 可以進(jìn)行點(diǎn)突變分析和等位基因分析，用不同的熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記 Taqman 探針，然后分別與野生型和突變型雜交，如果一種熒光信號明顯強(qiáng)于另一種熒光信號，則表明它是純合子；如果兩種熒光信號都明顯增強(qiáng)，則表明它是雜合子。另外分子信標(biāo)（ Molecular Beacon ）就是專門為這種技術(shù)設(shè)計(jì)的探針。
• 可以進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性的分析，檢測單核苷酸多態(tài)性對于研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定藥物的不同反應(yīng)有著重要的意義，因分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的巧妙性，一旦 SNP 的序列信息是已知的，采用這種技術(shù)進(jìn)行高通量的 SNP 檢測將會變得簡單而準(zhǔn)確。
• 可以進(jìn)行 DNA 甲基化檢測， DNA 甲基化同人類的許多疾病有關(guān)，特別是癌癥， Laird 報(bào)道了一種稱作 Methylight 的技術(shù)，在擴(kuò)增之前先處理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman 探針來區(qū)分甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。
• 對傳染性疾病進(jìn)行定量定性分析，這在我國應(yīng)用比較廣泛，大家比較熟悉。許多生產(chǎn)臨床 PCR 試劑的廠商已經(jīng)陸續(xù)推出了一系列的診斷試劑，如：肝炎系列、性病系列、腫瘤系列等等。
