自從1985年美國(guó)PE-Cetus公司的人類遺傳研究室 Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)（PCP） 以來(lái)，PCR已經(jīng)成為了分子生物學(xué)領(lǐng)域最基本也是最重要的技術(shù)手段之一 。然而能否找到一對(duì)合適的核苷酸片段作為引物，使其有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列，無(wú)疑決定著PCR的成敗�，F(xiàn)在動(dòng)物遺傳育種早已進(jìn)入了分子時(shí)代，在基因水平尋求影響動(dòng)物遺傳表型的新基因突顯重要，因此引物設(shè)計(jì)無(wú)疑又成為了尋找新基因的重中之重。

 

引物的設(shè)計(jì)與初步篩選基本上通過(guò)一些分子生物學(xué)軟件和相關(guān)網(wǎng)站來(lái)完成的， 目前運(yùn)用軟件Primer Premier 5 或美國(guó) whitehead 生物醫(yī)學(xué)研究所基因組研究中心在因特網(wǎng)上提供的一款免費(fèi)在線PCR引物設(shè)計(jì)程序 Primer 3來(lái)設(shè)計(jì)引物，再用軟件Oligo 6進(jìn)行引物評(píng)估，就可以初步獲得一組比較滿意的引物。但是對(duì)于初學(xué)者來(lái)說(shuō)，運(yùn)用軟件和程序來(lái)設(shè)計(jì)引物好象無(wú)從著手，其實(shí)只要我們掌握了引物設(shè)計(jì)的基本原則和注意事項(xiàng)，所有問(wèn)題便迎刃而解。因?yàn)闊o(wú)論是軟件還是程序，都是以這些基本原則和注意事項(xiàng)為默認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的。所以，我們?cè)谶M(jìn)行引物設(shè)計(jì)的時(shí)候大 可不必在軟件和程序的參數(shù)上花費(fèi)過(guò)多的時(shí)間來(lái)思考，如果沒(méi)有特殊要求我們完全可以把一些參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。下面我們主要討論一下引物設(shè)計(jì)的原則和注意事項(xiàng)。

①引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp，最好在18~24 bp，因?yàn)樘�短易形成錯(cuò)配(False priming) 降低特異性，而太長(zhǎng)也會(huì)降低特異性，并且降低產(chǎn)量 。

②引物在模板內(nèi)最好具有單一性，也就是說(shuō)在模板內(nèi)部沒(méi)有錯(cuò)配。特別是3’端，一定要避免連續(xù)4個(gè)以上的堿基互補(bǔ)錯(cuò)配。

③引物序列的GC 含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差異不要太大，3’端最后5個(gè)堿基最好不要富含GC，特別是連續(xù)3個(gè)的G或C。

④DNA雙鏈形成所需的自由能AG，應(yīng)該以5’端向 3’端遞減，3’端AG最好不要高于9．0 keaf mol 。

⑤避免形成穩(wěn)定的引物二聚體(Dimer and Cross DimeO 和發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)，AG高于4．5 keal／mol時(shí)易引發(fā) 上述兩種結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。

⑥ 引物所在的模板區(qū)域應(yīng)該位于外顯子區(qū)，最好跨越一個(gè)內(nèi)含子區(qū)，這樣便于對(duì)擴(kuò)增出來(lái)的片段進(jìn)行功能鑒定和表型分析。

⑦ 如果以DNA為模板設(shè)計(jì)引物，產(chǎn)物長(zhǎng)度在100—600 bp比較理想。而以mRNA為模板設(shè)計(jì)引物時(shí)，產(chǎn)物長(zhǎng)度在150—300 bp比較理想。

⑧5’ 端對(duì)PCR影響不太大，可以引進(jìn)修飾位點(diǎn)和標(biāo)記物 。

 

只要掌握了以上原則和注意事項(xiàng)，我們可以在軟件和程序設(shè)計(jì)的一組引物中篩選出幾對(duì)我們需要的目標(biāo)引物。Primer Premier 5和Oligo 6可以在/soft/下載，primer3的主頁(yè)位置在

 

http://www.genome.wi.mit.edu。

 

引物的二次篩選是指在初次篩選出的幾對(duì)引物中進(jìn)一步篩選出適合我們進(jìn)行特異、高效PCR擴(kuò)增的那對(duì)引物。本步應(yīng)注意以下兩點(diǎn)，一是得到的一系列引物分別在Genebank中進(jìn)行回檢。也就是把每條引物在比對(duì)工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) 的blast nr中進(jìn)行同源性檢索，棄掉與基因組其它部分同源性比較高的引物，也就是有可能形成錯(cuò)配的引物。一般連續(xù)10 bp以上的同源有可能形成比較穩(wěn)定的錯(cuò)配，特別是引物的3’端應(yīng)避免連續(xù)5-6 bp的同源。二是以mRNA為模板設(shè)計(jì)引物時(shí)要先利用生物信息學(xué)的知識(shí)大致判斷外顯子與內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)(例如http://CCR-081.mit.edu/GENESCAN.html的GENESCAN工具或者GeneParser軟件，然后棄掉正好位于剪接位點(diǎn)的引物。

 

當(dāng)我們經(jīng)過(guò)初次篩選和二次篩選后得到的那對(duì)引物便可以用于合成，合成后我們經(jīng)過(guò) PCR擴(kuò)增可以對(duì)引物進(jìn)行最終的評(píng)估。一是PCR擴(kuò)增的特異性和效率。經(jīng)過(guò)PCR條件優(yōu)化后能否獲得特異性條帶，即無(wú)目的條帶之外的多余條帶。另外，PCR產(chǎn)物的量是否足夠，即無(wú)不出帶和條帶很弱的現(xiàn)象。二是以DNA為模板設(shè)計(jì)引物時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否與預(yù)期PCR產(chǎn)物大小相當(dāng)。如果相差太大G 于100 b ，有可能是錯(cuò)配產(chǎn)物。三是是否形成引物二聚體帶。

我們結(jié)合引物最終評(píng)估和測(cè)序的結(jié)果可以對(duì)引物設(shè)計(jì)的成敗做出鑒定，為我們以后進(jìn)行引物設(shè)計(jì)積累寶貴經(jīng)驗(yàn)。

 

擴(kuò)增已知基因時(shí)經(jīng)過(guò)初次篩選和二次篩選后得到的引物基本上能夠滿足要求，但是當(dāng)運(yùn)用比較基因組學(xué)分離新基因時(shí)，設(shè)計(jì)引物還應(yīng)注意以下兩點(diǎn)：① 模板的選擇。如果以DNA為模板設(shè)計(jì)引物， 首先在Genebank中找到與待分離新基因同源的其它物種的該基因。利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/的Blast工具和http://www.ebi.ac.uk/elustalw/的Clustalw工具把已檢索到的基因進(jìn)行同源性比較，根據(jù)比較基因組定位的原理，選擇研究深入、標(biāo)記稠密的人和哺乳動(dòng)物(如小鼠)保守功能基因DNA序列設(shè)計(jì)引物[51，該引物區(qū)段要求在各物種間絕對(duì)保守，差異不要大于2 bp，特別是3’端必須完全同源。如果以電腦克隆策 略獲得的待分離物種新基因的EST一重疊群為模板設(shè)計(jì)引物，要求ESTs與信息探針之間同源性大于80％，長(zhǎng)度大于100 bp，并且避免在EST的并接部位和可能的外顯子與內(nèi)含子剪接位點(diǎn)處設(shè)計(jì)引物。②引物序列最好位于相臨的外顯子區(qū)且至少距離外顯子與內(nèi)含子剪接處25 bD以上，這樣便于對(duì)擴(kuò)增出來(lái)的片段進(jìn)行功能鑒定和表型分析。