1、SMART-seq

2012 年，由美國和瑞典的科學(xué)家共同開發(fā)了稱為 Smart-Seq（Switching mechanism at 5’end of the RNA transcript）的技術(shù) [1]。在 2013 年，Nature Methods 雜志上報(bào)告了新的方案，被稱為 Smart-Seq2[2]，隨后在 2014 年他們有公布了詳細(xì)的操作流程 [3]。獲取單細(xì)胞并裂解細(xì)胞后，含有 oligo-dT 的引物與 mRNA 的 poly- A 結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄酶 MMLV 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄酶到達(dá) mRNA 5’末端時(shí)，MMLV 的末端轉(zhuǎn)移酶活性會(huì)在一鏈 cDNA 的 3'末端增加額外的胞嘧啶，這時(shí) TSO 引物 3' 末端的 rGrG+ G 結(jié)合到首鏈末端的胞嘧啶，然后以首鏈 cDNA 為模版進(jìn)行延伸合成互補(bǔ)的第二鏈，全長 cDNA 經(jīng)過 PCR 擴(kuò)增后進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序文庫的構(gòu)建。

▲SMART-seq2 技術(shù)原理

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1、起始量低：1 個(gè)細(xì)胞起始，適用于難以滿足 10X Genomics 等平臺(tái)起始細(xì)胞量要求的樣本。

2、覆蓋度高： 測(cè)序覆蓋 cDNA 的全長序列，每個(gè)細(xì)胞能夠獲得上萬個(gè)基因的表達(dá)。

3、信息個(gè)性化： 除了獲得基因表達(dá)信息，數(shù)據(jù)能夠用于可變剪接，cSNP 等分析，以及帶 poly- A 結(jié)構(gòu)的 lncRNA 研究。

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文庫結(jié)構(gòu)

圖 SMART-seq2 文庫示意圖

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建議測(cè)序深度及參數(shù)

指標(biāo)	參數(shù)
測(cè)序深度	6Gb/cell
測(cè)序類型	PE150

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1、類型：新鮮組織，原代細(xì)胞，細(xì)胞系等。

2、來源：血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。

3、樣本量：?jiǎn)蝹�(gè)細(xì)胞（或微量細(xì)胞）。

4、保存運(yùn)輸：細(xì)胞放入 SMART-seq 試劑盒指定的裂解液中，-80°C 保存，干冰運(yùn)輸。

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2、10X Genomics

10X Genomics 公司的 Chromium 系統(tǒng)利用 8 通道的微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)，將含 barcode 的凝膠珠（Gel Beads）、細(xì)胞和酶的混合物、油三者混合，形成 GEMs（油包水的微體系）。GEMs 形成后，細(xì)胞裂解，凝膠珠自動(dòng)溶解釋放大量 barcode 序列，隨后 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有 10X barcode 和 UMI 信息的 cDNA，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序文庫，其中 10X barcode 用于區(qū)分細(xì)胞，UMI 用于區(qū)分 mRNA 分子。

圖 10X genomics 技術(shù)原理

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1、通量高： 一張芯片具有 8 個(gè)獨(dú)立的通道，可供 8 個(gè)樣本同時(shí)上機(jī)，每個(gè)通道可捕獲 10000 個(gè)細(xì)胞。

2、捕獲率高： 單細(xì)胞捕獲效率高達(dá) 65%，多細(xì)胞比例 <0.9%（1,000 個(gè)細(xì)胞中）。

3、延展性強(qiáng)： 除了獲得單細(xì)胞 mRNA 的信息，還提供了單細(xì)胞 TCR/BCR、單細(xì)胞表面蛋白、單細(xì)胞 ATAC 等多種解決方案。

 

  文庫結(jié)構(gòu)

圖 10X Genomics 3’gene expression 文庫示意圖

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建議測(cè)序深度及參數(shù)

指標(biāo)	參數(shù)
測(cè)序深度	50,000~100,000 reads/cell
測(cè)序類型	PE150

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1、類型：新鮮組織，原代細(xì)胞，細(xì)胞系等。

2、來源：血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。

3、樣本量及其它質(zhì)控要求：

樣本類型	樣本質(zhì)控要求
細(xì)胞懸液	>105 目標(biāo)細(xì)胞個(gè)數(shù)（底限 10,000 個(gè)細(xì)胞）；
	活率 >80%；
	濃度 500-1,000 個(gè)細(xì)胞 /ul；
	細(xì)胞間無粘連（成團(tuán)率 <5%）；
	無大于 40μm 的細(xì)胞碎片或其他顆粒物；
	不存在逆轉(zhuǎn)錄抑制劑和非細(xì)胞的核酸分子。
血液	EDTA 抗凝的全血（不可肝素抗凝），>5ml。
組織	0.3cm×0.3cm（不超過 0.5cm×0.5cm）的新鮮組織，4～5 塊。

4、保存運(yùn)輸：

（1）細(xì)胞懸液：建議現(xiàn)場(chǎng)制備，如要運(yùn)輸，建議使用伯豪生物自主研發(fā)的單細(xì)胞保護(hù)液，4°C 運(yùn)輸，48 小時(shí)內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室。

（2）血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 運(yùn)輸，2 小時(shí)內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室；或提取 PBMC 后凍存，干冰運(yùn)輸。

（3）組織：建議使用伯豪生物自主研發(fā)的單細(xì)胞組織保護(hù)液，4°C 運(yùn)輸，48 小時(shí)內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室。

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3、BD Rhapsody

BD Rhapsody 技術(shù)利用卡式芯片在磁性的寡核苷酸條形碼標(biāo)記微球上實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞捕獲和 mRNA 轉(zhuǎn)錄本的分子標(biāo)簽，然后將這些微球合并到單個(gè)管中用于 cDNA 擴(kuò)增和文庫構(gòu)建�？蓾M足 100~10000 個(gè)細(xì)胞的自動(dòng)分選、擴(kuò)增及建庫。

圖 BD Rhapsody 技術(shù)原理

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此外，該技術(shù)使用帶有寡核苷酸的高質(zhì)量抗體（Ab-oligos），這條寡核苷酸帶有抗體特異的條形碼，細(xì)胞在經(jīng)過 Ab-oligos 標(biāo)記后，可在單細(xì)胞水平同時(shí)獲得轉(zhuǎn)錄組和蛋白表達(dá)。

圖 單細(xì)胞 mRNA 與蛋白同時(shí)測(cè)序

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高 效	每個(gè)樣本可測(cè)  100~10000  個(gè)細(xì)胞；
	2 天內(nèi)完成細(xì)胞懸液制備、單細(xì)胞捕獲、擴(kuò)增以及建庫。
靈 活	抗體標(biāo)簽技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多樣本混合捕獲；
	可選擇全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序或目標(biāo)基因測(cè)序。
可靠	利用成像系統(tǒng)對(duì)單細(xì)胞捕獲過程進(jìn)行質(zhì)控；
	單細(xì)胞捕獲效率高達(dá) 80%，多細(xì)胞比例 <1%（1,000 個(gè)細(xì)胞中）。
整合	可同時(shí)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的 mRNA 水平與蛋白水平。

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文庫結(jié)構(gòu)

圖 BD Rhapsody 基因表達(dá)文庫示意圖

 

  建議測(cè)序深度及參數(shù)

指標(biāo)	參數(shù)
測(cè)序深度	50,000~100,000 reads/cell
測(cè)序類型	PE150

 

1、類型：新鮮組織，原代細(xì)胞，細(xì)胞系等。

2、來源：血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。

3、樣本量及其它質(zhì)控要求：

樣本類型	樣本質(zhì)控要求
細(xì)胞懸液	> 10*  目標(biāo)細(xì)胞個(gè)數(shù)（底限   10,000  個(gè)細(xì)胞）；
	活率 >80%；
	濃度 500-1,000 個(gè)細(xì)胞 /ul；
	細(xì)胞間無粘連（成團(tuán)率 <5%）；
	無大于 40um 的細(xì)胞碎片或其他顆粒物；
	不存在逆轉(zhuǎn)錄抑制劑和非細(xì)胞的核酸分子。
血液	EDTA  抗凝的全血（不可肝素抗凝），>5ml。
組織	0.3cm×0.3cm（不超過 0.5cm×0.5cm）的新鮮組織，4~5  塊。

 

4、保存運(yùn)輸：

（1）細(xì)胞懸液：建議現(xiàn)場(chǎng)制備，如要運(yùn)輸，建議使用伯豪生物自主研發(fā)的單細(xì)胞保護(hù)液，4°C 運(yùn)輸，48 小時(shí)內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室。

（2）血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 運(yùn)輸，2 小時(shí)內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室；或提取 PBMC 后凍存，干冰運(yùn)輸。

（3）組織：建議使用伯豪生物自主研發(fā)的單細(xì)胞組織保護(hù)液，4°C 運(yùn)輸，48 小時(shí)內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室。

圖 數(shù)據(jù)質(zhì)控及過濾

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圖 去除批次效應(yīng)

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圖 單細(xì)胞 RNA 測(cè)序細(xì)胞亞群注釋

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圖 單細(xì)胞 RNA 測(cè)序樣本間的細(xì)胞構(gòu)成差異

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圖 單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 Marker 基因分析

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圖 單細(xì)胞 RNA 測(cè)序擬時(shí)序分析

圖 單細(xì)胞 RNA 測(cè)序擬時(shí)序 GO 注釋

圖 單細(xì)胞 RNA 測(cè)序擬時(shí)序分化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖 單細(xì)胞 RNA 測(cè)序細(xì)胞亞群的功能富集分析

 

圖 單細(xì)胞 RNA 測(cè)序細(xì)胞亞群的功能富集在樣本間的差異

圖 單細(xì)胞 RNA 測(cè)序樣本間的功能差異分析

圖 細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)

1、胚胎發(fā)育

2、器官發(fā)育

3、干細(xì)胞分化

4、神經(jīng)科學(xué)

5、腫瘤微環(huán)境

6、用藥指導(dǎo)

7、病毒感染

[1] Ramskold D, Luo S, Wang YC, et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol 2012, 30(8):777-782.

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[10] Zheng C, Zheng L, Yoo JK, et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell 2017, 169(7):1342-1356.

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[12] Yu Zhao, Zixian Zhao, Yujia Wang, et al. Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCov. bioRxiv 2020.