YIJI活體細(xì)胞線粒體膜通道孔（MPTP）紅色熒光（TMRM）檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI活體細(xì)胞線粒體膜通道孔（MPTP）紅色熒光（TMRM）檢測試劑是一種旨在通過四甲基羅丹明甲酯染料，選擇性地聚集在線粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，一旦釋放到細(xì)胞漿，即刻發(fā)生熒光淬滅，來分析和觀察線粒體膜通道孔活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種活體細(xì)胞線粒體（動物、人體、昆蟲等）膜通道孔活性（開放狀態(tài)）的檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，活體檢測，分辨率高，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線粒體內(nèi)外膜成分構(gòu)成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細(xì)胞凋亡或壞死時，線粒體內(nèi)容物通過膜通道孔釋放到胞漿中。線粒體膜電位的去極化（depolarization），導(dǎo)致膜通道孔的開放，顯著改變線粒體的通透性，使之線粒體膨脹（swelling），內(nèi)容物釋放。其中鈣離子過度進入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導(dǎo)致膜通道孔的持續(xù)開放，而造成細(xì)胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失。四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester；TMRM），為羅丹明衍生物陽離子染料，作為電勢測定（potentiometric）熒光探針：第一，具有親脂性的； 第二，與線粒體內(nèi)膜負(fù)電極結(jié)合而聚集；第三，容易進入細(xì)胞及其線粒體。四甲基羅丹明甲酯進入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶切離，產(chǎn)生四甲基羅丹明。四甲基羅丹明進入線粒體后，被線粒體俘獲，呈現(xiàn)強烈熒光。一旦線粒體膜通道孔開放，四甲基羅丹明釋放出來而在胞漿重新分布，其熒光性顯著降低。線粒體內(nèi)熒光的變化，表明膜通道孔的開放狀態(tài)。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

YIJI清理液（Reagent A） 毫升

YIJI染色液（Reagent B） 微升

YIJI稀釋液（Reagent C） 毫升

產(chǎn)品說明書 1份

 

保存方式

 

保存YIJI染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

 

用戶自備

 

24孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于貼壁細(xì)胞染色的容器

1.5毫升離心管：用于染色工作液配制和細(xì)胞染色的容器

微型臺式離心機：用于沉淀細(xì)胞

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細(xì)胞熒光分析

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于細(xì)胞熒光定量分析

細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的YIJI染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升YIJI染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升YIJI稀釋液（Reagent C），混勻后，在冰槽里靜置，并標(biāo)記為YIJI染色工作液，放在暗室里。然后進行下列操作。

 

• 貼壁細(xì)胞染色

 

• 準(zhǔn)備1個細(xì)胞培養(yǎng)24孔板的預(yù)處理后待測細(xì)胞（注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和其它培養(yǎng)孔板，見注意事項8）
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預(yù)熱的YIJI清理液（Reagent A）到1個細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 小心抽去清理液
• 小心沿著孔壁加入xx微升含有YIJI染色液（Reagent B）和YIJI稀釋液（Reagent C）的YIJI染色工作液到1個細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 放進37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘，避免光照
• 小心抽去YIJI染色工作液
• 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預(yù)熱的YIJI清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔
• 小心抽去清理液
• 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預(yù)熱的YIJI清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔
• 選擇下列方式之一進行操作：

（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――紅色熒光減弱，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強

 

• 使用熒光酶標(biāo)儀檢測（定量檢測）：

放進熒光分光光度儀：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――RFU降低，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強

 

• 懸浮細(xì)胞或脫離細(xì)胞染色

 

• 將預(yù)處理后懸浮細(xì)胞或脫離細(xì)胞（1 X 10⁶細(xì)胞）移入到1.5毫升離心管
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升37℃預(yù)熱的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升含有YIJI染色液（Reagent B）和YIJI稀釋液（Reagent C）的YIJI染色工作液，充分混勻 
• 放進37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘，避免光照
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升37℃預(yù)熱的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升37℃預(yù)熱的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 選擇下列方式之一進行操作：
  • 進行細(xì)胞流式儀分析：激發(fā)波長488nm氬離子激光，散發(fā)波長570nm（FL2），觀察10000個細(xì)胞以上――

波峰左移，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強

 

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

1）移取10微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片 

2）激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――

綠色熒光減弱，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強

 

• 或使用熒光分光光度儀檢測（定量檢測）：

1）移取500微升上述細(xì)胞懸液到1毫升比色杯

2）加入xx微升YIJI清理液（Reagent A）

3）上下傾倒混勻數(shù)次

4）放進熒光分光光度儀：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――

RFU降低，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為20次（0.5毫升體系/次）操作
• 操作時，須戴手套
• 操作時，避免污染母液
• 染色前，所有試劑溶液，除YIJI染色液（Reagent B）外，需37℃預(yù)熱
• 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進行熒光檢測分析
• 孵育時，必須避免光照
• 本產(chǎn)品友好使用于雙重染色或重疊染色
• 本產(chǎn)品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細(xì)胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和各種培養(yǎng)孔板，須相應(yīng)調(diào)整處理液：

 

操作容器	建議操作體系
載玻片	100微升
載玻片培養(yǎng)皿	1毫升
35mm培養(yǎng)皿	1毫升
96孔培養(yǎng)板	100微升
48孔培養(yǎng)板	200微升
24孔培養(yǎng)板	500微升
12孔培養(yǎng)板	1毫升
6孔培養(yǎng)板	2毫升
25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶	3毫升

 

• 可以使用±10nm波長的濾波器
• 可以使用100微摩爾CaCl2處理的樣品作為膜通道孔開放的陽性對照
• 如果膜通道孔為瞬時開放（transient），則熒光緩慢且自發(fā)降低
• 本公司提供膜通道孔抑制劑：YIJI 0.2毫摩爾環(huán)胞素A（cyclosporine A）－GMS12226，維護熒光完整
• 本公司提供系列線粒體分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰

 

使用承諾

 

上海一基秉著“信譽至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。

上海一基實業(yè)有限公司多年專供：ELISA試劑盒，PCR恒溫?zé)晒鉁y試盒、朗道校準(zhǔn)品、校準(zhǔn)質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品|對照品、抗體|抗原、生物試劑、動物血清、人類CDNA、基因組DNA、MicroRNA產(chǎn)品、總RNA產(chǎn)品、人原代細(xì)胞裂解液、生物試劑、高端試劑等系列產(chǎn)品。如需產(chǎn)品詳細(xì)說明等物理性質(zhì)信息請聯(lián)系客服為您查詢！質(zhì)量保證，價格優(yōu)惠，是國內(nèi)生物試劑權(quán)威的供應(yīng)商之一，專業(yè)經(jīng)銷生物科學(xué)領(lǐng)域的品牌試劑：Sigma試劑、ASROS試劑、AIFA試劑、alding試劑、Fisher試劑、日本MBL試劑、美國劍橋CIL氘代試劑、ATCC菌株等品牌產(chǎn)品。擁有齊全的生產(chǎn)和檢測設(shè)備，實施嚴(yán)格的管理制度和完善的質(zhì)量保證體系，為廣大客戶提供全面的技術(shù)支持和完善的售后服務(wù)。歡迎來電咨詢!