PfAgo核酸內(nèi)切酶(PfAgo Endonuclease)來(lái)源于重組大腸桿菌,含有從激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)中克隆的Argonaute(Ago)核酸酶基因,是一種依托引導(dǎo)序列(guide DNA)與靶核酸堿基互補(bǔ)配對(duì),繼而特異識(shí)別并剪切靶核酸的核酸內(nèi)切酶。PfAgo 核酸內(nèi)切酶在5′
磷酸化的guide DNA(大于15 nt)引導(dǎo)下精準(zhǔn)剪切單鏈DNA底物,剪切位點(diǎn)位于與引導(dǎo)序列互補(bǔ)的5′
端開(kāi)始的第10和第11個(gè)核苷酸之間,剪切不受靶標(biāo)序列和剪切位點(diǎn)相鄰序列限制。本產(chǎn)品于95℃ 1 小時(shí),酶活性不損失。
包裝量與儲(chǔ)存條件:
JY0316包裝量為JY0316-S和JY0316-L,各組分于-20℃及以下運(yùn)輸及保存,有效期為24 個(gè)月。長(zhǎng)期保存建議放-80℃。
名稱 |
JY0316-S |
JY0316-L |
PfAgo Endonuclease |
200μL (200 U/μL) |
400μL (200 U/μL) |
10 × PfAgo Endonuclease Reaction Buffer |
0.5 mL |
1 mL |
使用方法:
- 自備以下儀器、試劑及耗材,輔助完成后續(xù)PfAgo Endonuclease切割反應(yīng)。
①儀器:PCR 儀器(ABI7500、 QuantStudio 5、Stepone plus)、金屬浴或水浴鍋;
②試劑:40 mM Mn2+( Nuclease-free H2O配制)、Nuclease-free H2O;
③合成引物:guide DNA:5′
P-TTTGGAGCTGGTGGCG 3′
;
ss DNA:5′-
6-FAM-CCTACGCCACCAGCTCCAACTACCACAA-BHQ1 3′
;
④耗材:Nuclease-free free EP 管。
2、按下表,配制反應(yīng)體系,并混合均勻。
名稱 |
體積 |
10 μM ssDNA |
2μL |
10 μM guide DNA |
4μL |
40 mM Mn2+ |
1μL |
10 ×PfAgo Endonuclease Reaction Buffer |
2μL |
PfAgo Endonuclease (200 U/μL) |
4μL |
Nuclease-free H2O |
up to 20μL |
注:一般使用20 μL 體系,但也可以等比例放大;
試驗(yàn)前用Nuclease-free H2O將ssDNA 、guide DNA 稀釋至相應(yīng)濃度。
2、95℃孵育30 min。
3. 反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行核酸膠電泳分析。如果不立即電泳,可以加入EDTA 終止反應(yīng),并先凍存于-20℃。
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