ChIP-seq等技術在揭示桃樹需冷量和芽休眠調控的關鍵基因中的應用
桃樹（Prunus persica）等多年生果樹的芽休眠是其冬季生存的關鍵策略，需冷量（chilling requirement，CR）是打破休眠的必要條件之一。然而，全球變暖導致許多地區(qū)的需冷量難以滿足，影響了桃樹的生長和發(fā)育。因此，理解需冷量和芽休眠（bud dormancy）的遺傳機制對于培育適應不同地理區(qū)域的低需冷量品種具有重要意義。
近日，中國農(nóng)科院鄭州果樹所桃資源與育種團隊趙亞林博士、李勇副研究員為共同第一作者，王力榮研究員為通訊作者，在《Plant Physiology》雜志發(fā)表題為“MADS-box protein PpDAM6 regulates chilling requirement-mediated dormancy and bud break in peach”科研成果，研究通過基因組關聯(lián)研究（GWAS）、染色質免疫共沉淀測序（ChIP-seq）等多種方法，系統(tǒng)分析了桃樹需冷量和芽休眠調控機制，并系統(tǒng)揭示了MADS-box蛋白PpDAM6基因的功能和調控網(wǎng)絡。
標題：MADS-box protein PpDAM6 regulates chilling requirement-mediated dormancy and bud break in peach（MADS-box蛋白PpDAM6調控桃樹需冷量介導的休眠和芽萌發(fā)）
發(fā)表期刊：Plant Physiology（植物生理學）
影響因子： IF 6.5 / 1區(qū)
技術平臺：ChIP-seq等
本研究通過基于345份桃樹（Prunus persica (L.) Batsch）材料的結構變異的全基因組關聯(lián)研究（GWAS），鑒定出PpDAM6（DORMANCY-ASSOCIATED MADS-box）是調控需冷量的關鍵基因。通過在桃樹芽中瞬時沉默PpDAM6基因，以及在轉基因蘋果（Malus×domestica）中穩(wěn)定過表達該基因，驗證了PpDAM6在需冷量調控中的功能。結果表明，PpDAM6在調控桃樹和蘋果的芽破眠、隨后的營養(yǎng)生長和開花過程中具有進化上保守的功能。PpDAM6啟動子區(qū)域的30-bp缺失與低需冷量品種中PpDAM6表達量的降低顯著相關�；谶@一30-bp插入/缺失（indel）開發(fā)的PCR標記可用于區(qū)分非低需冷量和低需冷量的桃樹品種。ChIP-seq結果表明，在低需冷量和非低需冷量品種中，PpDAM6位點的H3K27me3修飾在休眠過程中未表現(xiàn)出明顯變化，且從全基因組水平來看，低需冷量品種的H3K27me3修飾發(fā)生得更早。PpDAM6能夠通過誘導下游基因PpNCED1（9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶1，ABA生物合成的關鍵酶）和CALS（胼胝質合成酶）的表達來介導細胞間通訊。本研究揭示了由PpDAM6復合體形成的基因調控網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡介導了桃樹需冷量調控下的休眠和芽破眠過程。對需冷量自然變異遺傳基礎的深入理解，將有助于育種者開發(fā)適合在不同地理區(qū)域種植的不同需冷量品種。
圖形摘要：桃樹芽破眠相關遺傳組分的模型
研究方法
（1）基因組關聯(lián)研究（GWAS）
樣本選擇：選取345份桃樹材料，包括野生種、地方品種和改良品種。
測序和變異檢測：對這些材料進行全基因組重測序，識別結構變異（SVs）。
關聯(lián)分析：利用GWAS分析，將SVs與需冷量表型進行關聯(lián)，識別顯著的基因位點。
（2）候選基因鑒定
連鎖不平衡（LD）分析：通過LD分析縮小關聯(lián)信號區(qū)域，確定候選基因。
啟動子變異分析：識別PpDAM6啟動子區(qū)域的30-bp缺失，并通過Sanger測序驗證其與需冷量的關聯(lián)。
（3）功能驗證
病毒誘導基因沉默（VIGS）技術：在桃樹芽中瞬時沉默PpDAM6基因，觀察芽休眠和萌發(fā)的變化。
轉基因蘋果：在蘋果中過表達PpDAM6，觀察需冷量和芽萌發(fā)的變化。
擬南芥轉基因：在擬南芥中過表達PpDAM6，觀察開花時間和花器官發(fā)育的變化。
（4）表達分析
RT-qPCR：分析PpDAM6在不同需冷量品種中的表達水平。
啟動子活性分析：構建GUS報告基因載體，通過GUS染色和雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證啟動子活性。
（5）分子機制探索
ChIP-seq技術：分析PpDAM6基因位點的組蛋白修飾（如H3K27me3）變化。
酵母雙雜交和雙分子熒光互補（BiFC）：鑒定與PpDAM6相互作用的蛋白。
激素信號通路分析：研究PpDAM6與ABA和GA信號通路的關系。
結果圖形
（1）GWAS鑒定需冷量（CR）候選基因
研究者通過對345份桃樹材料的全基因組重測序數(shù)據(jù)進行分析，基于結構變異（SVs）識別與需冷量相關的基因位點。發(fā)現(xiàn)了一個顯著的信號，位于染色體1上的PpDAM6基因附近，特別是其啟動子區(qū)域的一個30-bp缺失（indel）與低需冷量表型顯著相關。
圖1：桃樹需冷量調控關鍵候選基因的GWAS分析和表達分析。
（2）PpDAM6基因的功能驗證
通過在桃樹芽中瞬時沉默PpDAM6基因，發(fā)現(xiàn)芽破眠和萌發(fā)時間提前。在轉基因蘋果中過表達PpDAM6，發(fā)現(xiàn)轉基因植株的需冷量增加，芽萌發(fā)時間延遲。
據(jù)報道，低溫條件下梨（pear）中DAM類基因的啟動子區(qū)域會出現(xiàn)類似H3K27me3的抑制性標記增加。但本研究并未觀察到在4°C低溫處理后，低需冷量（CR）或非低需冷量品種的PpDAM6位點上H3K27me3標記的顯著增加（圖3A）。這表明，與其他DAM類基因不同，PpDAM6抑制并非由于PpDAM6位點上H3K27me3增加所致。此外，在全基因組水平上，低需冷量品種的H3K27me3修飾發(fā)生得更早；然而，當需冷量滿足時，非低需冷量品種的三甲基化強度更高（圖3A和B）。這些結果表明，PpDAM6啟動子中的30-bp插入/缺失（indel）與PpDAM6的表達水平直接相關，進而與需冷量相關聯(lián)。
B. Metagene圖顯示桃樹參考基因組中轉錄基因區(qū)域兩端各延伸2kb的H3K27me3峰值分布。TSS表示轉錄起始位點；TES表示轉錄終止位點。
（3）PpDAM6通過反饋回路（feedback loop）方式參與ABA信號通路
PpDAM6可能通過ABA信號通路調控休眠。ABA含量在休眠期間逐漸下降，與PpDAM6表達模式相似。PpDAM6能夠正向調控ABA生物合成基因PpNCED1的表達，形成反饋回路。
（4）PpDAM6在休眠過程中協(xié)調細胞間通訊
PpDAM6通過調控PpCALS1/2基因的表達影響細胞間的胼胝質沉積（callose formation），進而調控細胞間通訊。胼胝質沉積在低溫積累過程中逐漸減少，與PpDAM6表達下調一致。
易小結
該研究通過GWAS和ChIP-seq等分析揭示了PpDAM6在桃樹需冷量和芽休眠調控中的關鍵作用，為理解多年生植物休眠的分子機制提供了新的視角。研究還通過開發(fā)基于30-bp indel的PCR標記，快速篩選出低需冷量的桃樹品種，為培育適應不同氣候條件的桃樹品種提供了有力工具。
本研究表明PpDAM6與ABA信號通路密切相關，進一步完善植物激素在休眠調控中的作用網(wǎng)絡。PpDAM6通過調控胼胝質沉積影響細胞間通訊，為理解芽破眠的細胞學基礎提供新線索。
ChIP-seq在本研究中的重要作用
本研究ChIP-seq技術用于分析PpDAM6基因位點的組蛋白修飾狀態(tài)，特別是H3K27me3修飾。幫助研究者了解PpDAM6在不同需冷量品種中的表觀遺傳調控機制。通過ChIP-seq分析，研究者發(fā)現(xiàn)PpDAM6基因位點的H3K27me3修飾在不同需冷量品種中沒有顯著差異。這表明PpDAM6的表達調控可能不依賴于H3K27me3修飾，而是與啟動子區(qū)域的30-bp缺失直接相關。
ChIP-seq技術還用于分析其他與需冷量相關的基因（如PpNCED1和PpCALS1/2）的組蛋白修飾狀態(tài)，這些基因的表達與PpDAM6密切相關，ChIP-seq幫助構建完整的基因調控網(wǎng)絡。
參考文獻：
Zhao YL, Li Y, Cao K, Yao JL, Bie HL, Khan IA, Fang WC, Chen CW, Wang XW, Wu JL, Guo WW, Wang LR. MADS-box protein PpDAM6 regulates chilling requirement-mediated dormancy and bud break in peach. Plant Physiol. 2023 Aug 31;193(1):448-465. pii: 7175985. doi: 10.1093/plphys/kiad291.
近日，中國農(nóng)科院鄭州果樹所桃資源與育種團隊趙亞林博士、李勇副研究員為共同第一作者，王力榮研究員為通訊作者，在《Plant Physiology》雜志發(fā)表題為“MADS-box protein PpDAM6 regulates chilling requirement-mediated dormancy and bud break in peach”科研成果，研究通過基因組關聯(lián)研究（GWAS）、染色質免疫共沉淀測序（ChIP-seq）等多種方法，系統(tǒng)分析了桃樹需冷量和芽休眠調控機制，并系統(tǒng)揭示了MADS-box蛋白PpDAM6基因的功能和調控網(wǎng)絡。
標題：MADS-box protein PpDAM6 regulates chilling requirement-mediated dormancy and bud break in peach（MADS-box蛋白PpDAM6調控桃樹需冷量介導的休眠和芽萌發(fā)）
發(fā)表期刊：Plant Physiology（植物生理學）
影響因子： IF 6.5 / 1區(qū)
技術平臺：ChIP-seq等
本研究通過基于345份桃樹（Prunus persica (L.) Batsch）材料的結構變異的全基因組關聯(lián)研究（GWAS），鑒定出PpDAM6（DORMANCY-ASSOCIATED MADS-box）是調控需冷量的關鍵基因。通過在桃樹芽中瞬時沉默PpDAM6基因，以及在轉基因蘋果（Malus×domestica）中穩(wěn)定過表達該基因，驗證了PpDAM6在需冷量調控中的功能。結果表明，PpDAM6在調控桃樹和蘋果的芽破眠、隨后的營養(yǎng)生長和開花過程中具有進化上保守的功能。PpDAM6啟動子區(qū)域的30-bp缺失與低需冷量品種中PpDAM6表達量的降低顯著相關�；谶@一30-bp插入/缺失（indel）開發(fā)的PCR標記可用于區(qū)分非低需冷量和低需冷量的桃樹品種。ChIP-seq結果表明，在低需冷量和非低需冷量品種中，PpDAM6位點的H3K27me3修飾在休眠過程中未表現(xiàn)出明顯變化，且從全基因組水平來看，低需冷量品種的H3K27me3修飾發(fā)生得更早。PpDAM6能夠通過誘導下游基因PpNCED1（9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶1，ABA生物合成的關鍵酶）和CALS（胼胝質合成酶）的表達來介導細胞間通訊。本研究揭示了由PpDAM6復合體形成的基因調控網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡介導了桃樹需冷量調控下的休眠和芽破眠過程。對需冷量自然變異遺傳基礎的深入理解，將有助于育種者開發(fā)適合在不同地理區(qū)域種植的不同需冷量品種。
圖形摘要：桃樹芽破眠相關遺傳組分的模型
研究方法
（1）基因組關聯(lián)研究（GWAS）
樣本選擇：選取345份桃樹材料，包括野生種、地方品種和改良品種。
測序和變異檢測：對這些材料進行全基因組重測序，識別結構變異（SVs）。
關聯(lián)分析：利用GWAS分析，將SVs與需冷量表型進行關聯(lián)，識別顯著的基因位點。
（2）候選基因鑒定
連鎖不平衡（LD）分析：通過LD分析縮小關聯(lián)信號區(qū)域，確定候選基因。
啟動子變異分析：識別PpDAM6啟動子區(qū)域的30-bp缺失，并通過Sanger測序驗證其與需冷量的關聯(lián)。
（3）功能驗證
病毒誘導基因沉默（VIGS）技術：在桃樹芽中瞬時沉默PpDAM6基因，觀察芽休眠和萌發(fā)的變化。
轉基因蘋果：在蘋果中過表達PpDAM6，觀察需冷量和芽萌發(fā)的變化。
擬南芥轉基因：在擬南芥中過表達PpDAM6，觀察開花時間和花器官發(fā)育的變化。
（4）表達分析
RT-qPCR：分析PpDAM6在不同需冷量品種中的表達水平。
啟動子活性分析：構建GUS報告基因載體，通過GUS染色和雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證啟動子活性。
（5）分子機制探索
ChIP-seq技術：分析PpDAM6基因位點的組蛋白修飾（如H3K27me3）變化。
酵母雙雜交和雙分子熒光互補（BiFC）：鑒定與PpDAM6相互作用的蛋白。
激素信號通路分析：研究PpDAM6與ABA和GA信號通路的關系。
結果圖形
（1）GWAS鑒定需冷量（CR）候選基因
研究者通過對345份桃樹材料的全基因組重測序數(shù)據(jù)進行分析，基于結構變異（SVs）識別與需冷量相關的基因位點。發(fā)現(xiàn)了一個顯著的信號，位于染色體1上的PpDAM6基因附近，特別是其啟動子區(qū)域的一個30-bp缺失（indel）與低需冷量表型顯著相關。
圖1：桃樹需冷量調控關鍵候選基因的GWAS分析和表達分析。
（2）PpDAM6基因的功能驗證
通過在桃樹芽中瞬時沉默PpDAM6基因，發(fā)現(xiàn)芽破眠和萌發(fā)時間提前。在轉基因蘋果中過表達PpDAM6，發(fā)現(xiàn)轉基因植株的需冷量增加，芽萌發(fā)時間延遲。
圖2：30bp缺失對PpDAM6啟動子活性的影響
據(jù)報道，低溫條件下梨（pear）中DAM類基因的啟動子區(qū)域會出現(xiàn)類似H3K27me3的抑制性標記增加。但本研究并未觀察到在4°C低溫處理后，低需冷量（CR）或非低需冷量品種的PpDAM6位點上H3K27me3標記的顯著增加（圖3A）。這表明，與其他DAM類基因不同，PpDAM6抑制并非由于PpDAM6位點上H3K27me3增加所致。此外，在全基因組水平上，低需冷量品種的H3K27me3修飾發(fā)生得更早；然而，當需冷量滿足時，非低需冷量品種的三甲基化強度更高（圖3A和B）。這些結果表明，PpDAM6啟動子中的30-bp插入/缺失（indel）與PpDAM6的表達水平直接相關，進而與需冷量相關聯(lián)。
圖3：桃樹中H3K27me3的ChIP-Seq分析及EVG位點中H3K27me3水平。
A. 可視化桃樹基因組中的H3K27me3 peaks值IGV圖。藍色峰值代表低需冷量品種（LCR）中的H3K27me3，綠色峰值代表高需冷量品種（HCR）中的H3K27me3分布。紅色方框表示一個基因的不同轉錄本，DAM基因上的峰值用紫色方框標記。PpDAM2位于PpDAM1覆蓋的區(qū)域內(nèi)，特別用黑色方框圈出。LCR-1和HCR-1代表休眠開始階段；LCR-3和HCR-3代表芽破眠階段。B. Metagene圖顯示桃樹參考基因組中轉錄基因區(qū)域兩端各延伸2kb的H3K27me3峰值分布。TSS表示轉錄起始位點；TES表示轉錄終止位點。
圖4：在轉基因蘋果和桃花芽瞬時轉化中驗證了 PpDAM6 的芽萌發(fā)和需冷量介導的休眠調控。
（3）PpDAM6通過反饋回路（feedback loop）方式參與ABA信號通路
PpDAM6可能通過ABA信號通路調控休眠。ABA含量在休眠期間逐漸下降，與PpDAM6表達模式相似。PpDAM6能夠正向調控ABA生物合成基因PpNCED1的表達，形成反饋回路。
圖5：PpDAM6參與ABA信號通路。
（4）PpDAM6在休眠過程中協(xié)調細胞間通訊
PpDAM6通過調控PpCALS1/2基因的表達影響細胞間的胼胝質沉積（callose formation），進而調控細胞間通訊。胼胝質沉積在低溫積累過程中逐漸減少，與PpDAM6表達下調一致。
圖6：PpDAM6介導細胞間通訊。
圖7：CALS1/2和NCED1在休眠桃花芽中的功能驗證。
易小結
該研究通過GWAS和ChIP-seq等分析揭示了PpDAM6在桃樹需冷量和芽休眠調控中的關鍵作用，為理解多年生植物休眠的分子機制提供了新的視角。研究還通過開發(fā)基于30-bp indel的PCR標記，快速篩選出低需冷量的桃樹品種，為培育適應不同氣候條件的桃樹品種提供了有力工具。
本研究表明PpDAM6與ABA信號通路密切相關，進一步完善植物激素在休眠調控中的作用網(wǎng)絡。PpDAM6通過調控胼胝質沉積影響細胞間通訊，為理解芽破眠的細胞學基礎提供新線索。
ChIP-seq在本研究中的重要作用
本研究ChIP-seq技術用于分析PpDAM6基因位點的組蛋白修飾狀態(tài)，特別是H3K27me3修飾。幫助研究者了解PpDAM6在不同需冷量品種中的表觀遺傳調控機制。通過ChIP-seq分析，研究者發(fā)現(xiàn)PpDAM6基因位點的H3K27me3修飾在不同需冷量品種中沒有顯著差異。這表明PpDAM6的表達調控可能不依賴于H3K27me3修飾，而是與啟動子區(qū)域的30-bp缺失直接相關。
ChIP-seq技術還用于分析其他與需冷量相關的基因（如PpNCED1和PpCALS1/2）的組蛋白修飾狀態(tài)，這些基因的表達與PpDAM6密切相關，ChIP-seq幫助構建完整的基因調控網(wǎng)絡。
參考文獻：
Zhao YL, Li Y, Cao K, Yao JL, Bie HL, Khan IA, Fang WC, Chen CW, Wang XW, Wu JL, Guo WW, Wang LR. MADS-box protein PpDAM6 regulates chilling requirement-mediated dormancy and bud break in peach. Plant Physiol. 2023 Aug 31;193(1):448-465. pii: 7175985. doi: 10.1093/plphys/kiad291.
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