神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)通過直接或間接調(diào)控神經(jīng)元活動，在認(rèn)知和行為過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。非人類靈長類動物（NHPs）研究因缺乏可靠測量多種神經(jīng)遞質(zhì)的方法，難以捕捉這種復(fù)雜性。微透析（Microdialysis，MD）技術(shù)可在體內(nèi)測量腦組織中多種分子濃度，但在 NHPs 應(yīng)用較少。該研究旨在開發(fā)一種新型半慢性微透析技術(shù)，結(jié)合高靈敏度分析手段，實(shí)現(xiàn)在清醒NHPs中多神經(jīng)遞質(zhì)的同步測量與動態(tài)比較。
 

該研究的作者團(tuán)隊由來自倫敦大學(xué)的Stella Mayer、Iryna Danylenko、Viktoria A. Misiak、John C. Rothwell以及來自英國醫(yī)學(xué)研究委員會分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Seth G. Grant組成。他們憑借在神經(jīng)科學(xué)、實(shí)驗(yàn)技術(shù)等多個領(lǐng)域積累的深厚專業(yè)知識，進(jìn)行了在清醒恒河猴上建立體內(nèi)腦微透析技術(shù)的研究。

研究人員通過半慢性微透析（MD）采樣，對比動物 “活躍” 和 “非活躍” 兩種行為狀態(tài)下六種神經(jīng)遞質(zhì)及膽堿的濃度。實(shí)驗(yàn)時，動物坐在特制靈長類座椅上，頭部活動受限，使用眼動儀監(jiān)測眼動，刺激呈現(xiàn)在動物前方的顯示器上。當(dāng)動物未參與行為任務(wù)（如因困倦或缺乏動機(jī)）時為非活躍狀態(tài)，參與任務(wù)時為活躍狀態(tài)。
 

圖1 恒河猴半慢性 MD 系統(tǒng)示意圖

注：標(biāo)準(zhǔn)的 MD 設(shè)置包括一個導(dǎo)向器和一個探針，探針的尖端有一層半透膜，放置在感興趣的大腦區(qū)域（圖 1）。該膜允許分子在低于膜的截留分子量值時，從細(xì)胞外空間（高濃度區(qū)域）到探針內(nèi)部（低濃度區(qū)域）的凈擴(kuò)散。入口和出口管分別允許用人工腦脊液 （aCSF） 灌注探針和收集樣本。

研究人員選用1只19歲、13.5 kg的成年雄性恒河猴作為研究對象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為了確定皮質(zhì)神經(jīng)遞質(zhì)的濃度，使用CMA 12 Elite探針從位于上顳溝后岸的 MT 區(qū)域的三個不同位置（TR-1、TR-2、TR-3）（圖3 A）采集細(xì)胞外液樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。該研究采用新方法，即通過可拆卸插入物半慢性植入 MD 導(dǎo)管和探針。該插入物由生物相容性樹脂 3D 打印而成，放置在標(biāo)準(zhǔn) PEEK （聚醚醚酮）記錄室內(nèi)，其結(jié)構(gòu)設(shè)計有助于固定導(dǎo)頭、清潔腔室和防止探針位移。MD 導(dǎo)管由聚氨酯制成，帶可拆卸尖頭不銹鋼針，MD 探針為定制不銹鋼軸，探針半透膜由 PAES 制成，可確保采樣穩(wěn)定。通過使用插入物將探針半慢性植入目標(biāo)區(qū)域后，利用注射泵裝置，把 aCSF泵入入口管，選擇 1 μL/min 的灌注速率進(jìn)行灌流，以此平衡時間分離度和分析物回收率。該實(shí)驗(yàn)12min收集一次樣品，樣品收集完成后使用MRI 掃描驗(yàn)證探針位置后對樣本進(jìn)行檢測分析。

圖2 用于 MD 采樣的三種 MT 軌跡（TR-1、TR-2 和 TR-3;TR=trajectory）

圖3 用于 MD 采樣的三種 MT 軌跡（TR-1、TR-2 和 TR-3;TR=trajectory）

樣品收集完成后，研究人員采用超高效液相色譜-電噴霧電離-質(zhì)譜法（UHPLC-ESI-MS），以低樣品量（每個樣品 12μL）對 18 個樣品（9 個活躍狀態(tài)、9 個非活躍狀態(tài)，18 天內(nèi)收集）中的 6 種神經(jīng)遞質(zhì)（DA、NE、LE、5-HT、Glu、GABA）和膽堿的相對濃度進(jìn)行量化。為控制小樣品化合物組成可能產(chǎn)生的誤差，在三個時間點(diǎn)測量，每種化合物均測量三次。結(jié)果顯示，多數(shù)樣品的誤差不超 20%，如 GABA、谷氨酸、膽堿、去甲腎上腺素、血清素等大部分樣品誤差在相應(yīng)較低范圍內(nèi)；腎上腺素和多巴胺部分樣品誤差相對較高。

研究人員通過對細(xì)胞外液中神經(jīng)遞質(zhì)濃度值的額外分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了在恒河猴 MT 區(qū)域采樣和檢測神經(jīng)遞質(zhì)的方法，并展示了 “活躍” 和 “非活躍” 狀態(tài)下 GABA、谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)及膽堿濃度的頻率直方圖。

圖4 七種神經(jīng)遞質(zhì)濃度的頻率分布

后續(xù)進(jìn)一步計算了每種神經(jīng)遞質(zhì)在不同行為狀態(tài)下的變異系數(shù)（CV）并針對每個樣本，計算各神經(jīng)遞質(zhì)對之間的 Spearman 相關(guān)性，以此探究神經(jīng)遞質(zhì)的共調(diào)節(jié)和動態(tài)相互作用。結(jié)果顯示 “活躍” 狀態(tài)下的 CV 值始終高于 “不活躍” 狀態(tài)，這可能反映出恒河猴在 “活躍” 狀態(tài)下行為表現(xiàn)的變異性更大，而 “不活躍” 狀態(tài)相對穩(wěn)定、喚起水平較低；“活躍” 狀態(tài)時，多巴胺、膽堿、去甲腎上腺素、谷氨酸和血清素等神經(jīng)遞質(zhì)間存在顯著正相關(guān)，意味著這些神經(jīng)遞質(zhì)的濃度變化具有一致性，可能共同參與并依賴于猴子的任務(wù)執(zhí)行和行為表現(xiàn)；“不活躍” 狀態(tài)下，GABA 與其他神經(jīng)遞質(zhì)存在顯著相關(guān)性，其中與膽堿、腎上腺素呈強(qiáng)正相關(guān)，與去甲腎上腺素呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，表明 GABA 在 “不活躍” 狀態(tài)下對其他神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)作用突出，反映出該狀態(tài)下神經(jīng)元活動的抑制性調(diào)制增強(qiáng)。

圖5 活躍” 和 “不活躍” 行為塊樣本中七種神經(jīng)遞質(zhì)的濃度值，以及這兩種行為塊的變異性（CV）測量結(jié)果
 

圖6  Spearman 在“活躍”和“非活躍”狀態(tài)下的相關(guān)性

透析技術(shù)能在體實(shí)時采集生物樣本，精準(zhǔn)測定神經(jīng)遞質(zhì)、代謝物等多種生物分子的動態(tài)變化，為探究大腦神經(jīng)化學(xué)機(jī)制、疾病病理生理過程以及評估藥物療效等研究提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)支撐，有力推動了神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等多領(lǐng)域的發(fā)展。在此基礎(chǔ)上，研究人員運(yùn)用新型半慢性腦微透析技術(shù)，對清醒恒河猴不同認(rèn)知狀態(tài)下大腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)的濃度變化展開研究。結(jié)果表明，“活躍” 狀態(tài)下神經(jīng)遞質(zhì)濃度的變異性更高，其中 GABA 和 5-HT濃度顯著增加，這一發(fā)現(xiàn)揭示了神經(jīng)遞質(zhì)在認(rèn)知功能中的動態(tài)調(diào)節(jié)作用，為相關(guān)神經(jīng)疾病研究開拓了新視角。

參考文獻(xiàn)：Mayer S, Saxena P, Crayen MA, et al. Establishing In-vivo brain microdialysis for comparing concentrations of a variety of cortical neurotransmitters in the awake rhesus macaque between different cognitive states. J Neurosci Methods. 2025 Mar;415:110361.

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