離子交換層析（Ion Exchange Chromatography, IEX）是一種基于蛋白等電點(diǎn)（pI）和緩沖液 pH 之間的電荷差異，利用離子交換介質(zhì)對(duì)帶正電（陽離子交換）或負(fù)電（陰離子交換）的蛋白進(jìn)行分離的方法。該方法可用于蛋白純化、去除雜質(zhì)、濃縮目標(biāo)蛋白等。

 

離子交換層析依賴于蛋白的凈電荷與固定相的相互作用：
 

陽離子交換層析（Cation Exchange, CEX）：固定相帶負(fù)電，結(jié)合帶正電的蛋白（pH < pI）。
常用填料：CM-Cellulose, SP-Sepharose。

陰離子交換層析（Anion Exchange, AEX）：固定相帶正電，結(jié)合帶負(fù)電的蛋白（pH > pI）。
常用填料：DEAE-Cellulose, Q-Sepharose。

在不同鹽濃度（如 NaCl 梯度）或 pH 梯度的作用下，結(jié)合的蛋白被依次洗脫，實(shí)現(xiàn)分離。

 

(1) 試劑與填料

(2) 設(shè)備

層析柱（如 HiTrap Q FF 5 mL, HiTrap SP FF 5 mL）。

層析系統(tǒng)（Hass25 AKTA、FPLC等）。
（圖例使用輝因科技全具備自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)國產(chǎn)蛋白純化系統(tǒng)Hy-Hass25）

輝因科技蛋白純化系統(tǒng)Hy-Hass25

紫外檢測儀（280 nm 監(jiān)測蛋白洗脫）。

3. 實(shí)驗(yàn)步驟

Step 1. 預(yù)處理

樣品準(zhǔn)備：

細(xì)胞裂解、離心（10,000 x g, 10 min），取上清。

0.22 μm 過濾，去除顆粒和雜質(zhì)。

調(diào)節(jié)緩沖液 pH 以確保目標(biāo)蛋白帶相應(yīng)電荷（pH < pI 選 CEX，pH > pI 選 AEX）。

調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，低鹽（<50 mM NaCl）可增強(qiáng)蛋白吸附。

柱子平衡：

用 5 倍柱體積（CV）的平衡緩沖液清洗柱子，流速 1-2 mL/min。

監(jiān)測 280 nm 吸光度，確保基線穩(wěn)定。

Step 2. 蛋白結(jié)合

樣品加載：

以 1 mL/min 低流速 加載蛋白（最大不超過柱體積的 10%）。

監(jiān)測 280 nm，確保蛋白吸附完全（流出液 A280 降低）。

洗滌雜質(zhì)：

繼續(xù)用平衡緩沖液清洗柱子，直到流出液 A280 降至基線（去除未結(jié)合蛋白）。

Step 3. 洗脫蛋白

梯度洗脫：

使用 0-1 M NaCl 線性梯度（通常 10-20 CV）。

逐步增加鹽濃度，使不同結(jié)合力的蛋白依次洗脫。

監(jiān)測 280 nm，記錄蛋白洗脫峰。

等度洗脫（可選）：

直接用 0.5-1 M NaCl 緩沖液一步洗脫目標(biāo)蛋白（適用于已知洗脫條件的蛋白）。

Step 4. 分段收集與后處理

收集洗脫組分：

根據(jù) UV 吸收峰，分段收集蛋白組分。

用 SDS-PAGE 確定目標(biāo)蛋白所在的洗脫組分。

緩沖液置換：

透析或超濾換至目標(biāo)緩沖液（如 PBS、Tris-HCl）。

濃縮蛋白（如使用 10 kDa 超濾離心管）。

4. 優(yōu)化策略

(1) 提高分辨率

降低流速（0.5-1 mL/min），減少峰擴(kuò)散。

優(yōu)化梯度洗脫（線性梯度 vs. 分步梯度）。

(2) 提高結(jié)合效率

選擇合適的 pH，使蛋白帶足夠電荷。

低離子強(qiáng)度（<50 mM NaCl）有助于蛋白結(jié)合。

(3) 目標(biāo)蛋白洗脫優(yōu)化

低 pH 或高 pH 改變蛋白電荷狀態(tài)，幫助洗脫。

除了 NaCl，也可嘗試 KCl 或 (NH₄)₂SO₄。

5. 結(jié)果分析

SDS-PAGE：檢測目標(biāo)蛋白的純度。

UV 280 nm 吸收峰：確認(rèn)目標(biāo)蛋白的洗脫位置。

蛋白濃度測定（Bradford/BCA 法）：計(jì)算蛋白回收率。

6. 常見問題及解決方案

問題 可能原因 解決方案

目標(biāo)蛋白未結(jié)合柱子 pH 不合適，蛋白未帶電 調(diào)整 pH 使蛋白帶電

目標(biāo)蛋白流失在洗脫前 樣品鹽濃度過高 降低 NaCl 濃度 <50 mM

目標(biāo)蛋白洗脫不完全 鹽濃度不夠 提高 NaCl 梯度（0-1 M）

目標(biāo)蛋白變性 pH 過低或過高 選擇溫和 pH（pH 6-8）

7. 典型實(shí)驗(yàn)參數(shù)

參數(shù) 設(shè)定值

柱體積 5 mL (HiTrap Q/SP)

流速 1 mL/min

平衡緩沖液 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl

洗脫方式 0-1 M NaCl 梯度洗脫 (20 CV)

收集方式 1 mL 分段收集

儀器 盡量選擇優(yōu)質(zhì)穩(wěn)定的儀器，這樣可以去除設(shè)備因素

總結(jié)

離子交換層析是一種高效的蛋白純化方法，通過調(diào)節(jié) pH 和鹽梯度，可獲得高純度目標(biāo)蛋白。合理選擇 緩沖體系、填料和梯度洗脫方式，可顯著提高分辨率和回收率。

 

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